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化学发光酶免疫法测定水产品中残留氯霉素

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1 引 言

氯霉素(CAP)能抑制人体骨髓造血功能,引起人类再生障碍性贫血,粒状白细胞缺乏症,新生儿,早产儿灰色综合症等疾病。我国禁止在动物饲料中使用。免疫分析法操作简单,快速,通常用来大规模筛选样品。但目前常用的显色ELISA(cELISA)的检出限一般在0.1μg/L左右,而CAP的允许的最大残留量(MRL)也在0.1μg/L,并且MRL还有下调的趋势。因此cELISA方法难以达到检测要求。而本研究建立的化学发光酶免疫检测方法(CLEIA)检测对虾组织中残留的CAP,检测灵敏度可达到0.01μg/L;检测范围为0.03~23.7μg/L,可满足CAP残留的检测要求。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂 发光底物液SuperSignalλ(美国Hyclone2Pierce公司)。抗CAP鼠单克隆抗体(Abcam公司),免疫原为CAP2KLH。CAP2BSA为本实验室研制。确保未曾饲用CAP的虾购自广东某供港养殖场;CAP系列标准溶液:由国家进出口商品检验检疫研究所赠送,经HPLC测定的100μg/L标准储液系列稀释而成。LuminoskanAscent化学发光检测仪、可调式移液器和8×12可拆发光检测黑板(ThermoLabsystems公司)。

2.2 实验方法 (1)竞争CLEIA(competitiveCLEIA,CLEIA)方法检测CAP的建立 (A)0.2g/LCAP2BSA溶液,包被黑色检测板,50μL/孔,4℃过夜;(B)次日取出,回至室温,PBST洗涤3次,加入20g/L的BSA溶液,100μL/孔,封闭,4℃过夜;(C)先加入0.0、0.01、0.05、……、31.25μg/L系列CAP标准溶液,20μL/孔,每个浓度重复5次,随后加入1mg/L的一抗,30μL/孔,剩下孔加入50μLPBST,作为空白对照,室温30min;(D)洗涤后,加入1∶4000稀释的HRP2IgG,50μL/孔,室温30min;(E)加入发光底物,50μL/孔,LuminoskanAscent化学发光检测仪里面稳定2min,测425nm光强度,检测时间1s。用四参数方程拟合标准曲线:LU/LU0=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。其中LU/LU0为各标准浓度的光强度(lightunit,LU)与0标准浓度的LU的比值;x为标准液或分析物浓度,A和D分别为0标准液的LU和空白对照的LU,C为ED50点的浓度,B为ED50点处的斜率;(2)精确性和准确性测定 虾洗净后,去头、去壳,取虾仁为分析样品。取4支10mL玻璃匀浆器分别编号为1#、2#、3#、4#。称虾仁5g于4支玻璃匀浆器中,分别加入8、7.95、7.9和7.6mL乙酸乙酯,并于匀浆器中分别加入100μg/LCAP标准储液0、5、100和400μL,配成0μg/kg(阴性对照)、0.1
μg/kg(低浓度)、2μg/kg(中浓度)和8μg/kg(高浓度)4个水平。匀浆30min,转移至15mL离心管中,匀浆器用2mL乙酸乙酯冲洗,与匀浆液合并,4000r/min室温离心10min。吸取上清液,在N2流下干燥。2mL正己烷溶解干燥物后,加入1mLPBST,剧烈混匀后离心。沉淀用1mL正己烷溶解,离心后合并。每个浓度6次重复,分别计算批间(连续测定4d)和批内相对标准偏差及回收率。

3 结果与结果

3.1 最优竞争时间的确定 CAP标准溶液和一抗添加到酶标板后,测定不同竞争时间(10~60min)下的标准曲线。结果表明:反应时间在10~30min内,LUmax随时间延长而增大,而ED50随时间延长而减小;反应时间超过30min,LUmax变化趋于平稳,而ED50却增加;因此,30min为本系统的最佳竞争反应时间,此时,ED50最小,LUmax/ED50最大。

3.2 Tween220最优浓度的确定 Tween220浓度小于0.1%时,LUmax和ED50均增大;大于0.1%时,LUmax减小,而ED50变化不大;等于0.1%时,ED50较小,LUmax/ED50最大。测定非特异吸附也比较小,故选择0.1%为Tween220的最优浓度。

3.3 PBS离子强度的确定 LUmax和ED50均随着PBS溶液的离子强度增加而减小。PBS浓度为0.2mol/L时,LUmax/ED50最大,所以选择0.2mol/L为PBS的最佳浓度。

3.4 PBS溶液的最优pH的确定 pH小于7.5时,随pH增大,ED50下降很快(3.1→1.25),LUmax有下降趋势,但降减幅度不大。pH小于5.5时,反应被抑制。pH等于7.5时,LUmax为1.02。同时LUmax/ED50最大,7.5为PBS最佳pH。

3.5 ic2CLEIA标准曲线 从ic2CLEIA标准曲线可以查得ED50值为0.47μg/L,检测范围(20~80%LU/LU0对应的浓度)为0.03~23.7μg/L;检出限(90%LU/LU0对应的浓度)为0.008μg/L。

3.6 精确性与准确性的测定 批内批间的相对标准偏差(RSD)都小于15%,说明本ic2CLEIA的准确性在实验误差范围之内。而平均回收率在95%~123%之间,也表明ic2CLEIA的平行性和准确性较高。

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