FACSAria流式细胞仪无菌分选的基本流程

一、 环境和液流的消毒
1、 准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。
2、 房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。

二、 开机和管道的消毒
1、 将Sheath液换为活性氯浓度为0.5%的次氯酸钠溶液（不要用75％的酒精），开机。开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。一般来说，100μm的喷嘴选用Low，而70μm的喷嘴选用middle。
2、 打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常。如果出现异常，可以通过调整喷嘴的位置，改变Breakoff 窗口的Amplitude的大小和打开Attenuation开关等来进行调整。（具体操作可参考Instrument User’s Guide的194－200页），直至液流形态和位置符合分选要求。
3、 在上样管中装入1ml 活性氯浓度为0.5%的次氯酸钠溶液,将上样管放在上样架上，点击Acquisition窗口的Load开关，运行15－20分钟后，点击Unload开关，取下上样管。
4、 将Sheath液换为无菌PBS，先后执行Fluidics shutdown和Fluidics startup程序各一次。

通过上述操作完成了环境和管道的消毒，为分选准备了无菌的环境，在后续的操作中应注意保持，以确保分选样本不被污染。

二、 分选相关参数的调节
1、 在side－stream window中，打开Voltage开关，确定在打开Voltage开关后，液流没有偏离中心位置，如果有偏离可以调整Voltage center，使其回到中间位置。
2、 打开Test Sort，通过调整电压的大小来调整side stream的位置。让side stream能够正好落入收集管的相应位置中。
3、 点击Browser中的Experiment图标，创立一个新的Experiment，并改名为Accudrop。
4、 在Sheet或者Template中创立FSC图，并画一个可以包含所有Plot的gate。
5、 打开Sort Layout，将Precision mode设置为purify，Target Events设置为continuous。
6、 上一管装有Accudrop Beads的样品管。
7、 调整速率，使获取速度为2000－4000events每秒。注意速率不要超过4。
8、 点击打开Voltage，点击sort按钮，点击Optical Filter，调节drop delay，使屏幕左边的方框中的数值为98％以上，即调整好了drop delay。Drop delay是影响分选质和量的重要指标，一定要调整好。

通过上述操作即完成了全部的分选前的环境消毒和某些参数的调试工作，后续和分析无较大差别。

在整个的无菌分选过程中，要时刻注意保持无菌的环境，注意观察液流的形态和位置。当液流出现异常时，一定要停止分选，及时的调整，因为正确的液流形态和位置是保证分选纯度的前提条件。当分选结束后，应该及时将Sheath液换为去离子水，并执行Fluidics shutdown和Fluidics Startup程序各两次，用去离子水彻底的冲洗管道，以免PBS在管道中沉积，结晶。

 

摘自《丁香园》