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无菌小鼠代孕技术

相关实验:无菌小鼠代乳及代孕技术

最新修订时间:

简介

无菌小鼠代孕技术,是以无菌小鼠(如昆明小鼠, KM)) 作为胚胎受体,将 SPF 级的相同或不同品系的小鼠(如 C57BL6/J) 作为胚胎供体,将胚胎收集后移植到无菌小鼠的输卵管中,受体经过妊娠,产下并哺育后代小鼠,从而获得与供体鼠同品种的无菌小鼠。胚胎移植 (embryo transfer) 的胚胎来源可以鲜胚,也可以是冻胚。


原理

无菌小鼠代孕技术的基本原理是以无菌小鼠(如昆明小鼠, KM)) 作为胚胎受体,将 SPF 级的相同或不同品系的小鼠(如 C57BL6/J) 作为胚胎供体,将胚胎收集后移植到无菌小鼠的输卵管中,受体经过妊娠,产下并哺育后代小鼠,从而获得与供体鼠同品种的无菌小鼠。

材料与仪器

器材:


体式显微镜、无菌手术隔离器、 Gustafsson 不锈钢制无菌隔离器、高压灭菌锅、无菌小鼠饲养隔离器、传递桶、超净工作台等。


试剂:


①0.3% 戊巴比妥钠溶液 ;


②无菌 PBS 或蒸熘水 ;


③ PMSG;


④ hCG;


⑤ 过氧乙酸;


⑥ 过滤处理的 M2 培养基;


⑦ M16 培养基;


⑧ 0.01mol/L NaOH 溶液。

步骤

无菌小鼠代孕技术的基本过程可分为如下几步:


(一)受体鼠准备。

用作胚胎移植受体假孕鼠 (donor pseudopregnant females) 是通过用结扎输精管或遗传不育雄鼠交配自然发情母鼠来制备的。假孕受体鼠的制备包括以下过程:


A. 绝育雄鼠的制备:将具有良好配种记录的与受体鼠同系 (KM) 的雄鼠 (2 月龄以上),用 0.3% 戊巴比妥钠溶液按 1 mL/l00 g 的剂量腹腔注射,完全麻醉后,用剪刀在其腰腹部正中剪开一条约 2 cm 的横向切口,用钝头镊子将一侧睾丸拉出,找到输精管后用剪刀截去输精管的中间部分。两侧的输精管结扎 (vasectomy) 后将睾丸放回腹腔,缝合切口后单独饲养,注意保温。结扎恢复后至少要先进行 1 周的配种实验,确认公鼠不育且有见栓记录,才能用于正式实验。


B. 受体鼠与绝育雄鼠交配:受体母鼠 (receptor female) 至少应该在 6-8 周龄,体重不宜过大,将可用的绝育雄鼠与受体鼠于下午 17:00 左右按 1: 1 比例合笼(为了增加见栓率可按 1: 2 比例合笼),第二天早上检查阴栓,见栓后 0.5 天的假孕鼠用作胚胎输卵管部位移植的受体鼠。


注意事项:由于受体鼠为代孕鼠,是已经获得的无菌小鼠(如本实验室已有的无菌 KM 鼠),所以雄鼠结扎手术应在无菌手术隔离器内进行,然后转入无菌隔离器内饲养,所有的操作过程必须保证无菌。

(二)供体胚胎制备。

供体胚胎的制备是无菌小鼠代孕技术的关键部分,胚胎的好坏直接影响受体鼠的妊娠和产仔率。供体胚胎的制备过程主要包括供体鼠的超数排卵、胚胎的收集。


A. 供体鼠的超数排卵:①准备激素:注射前,用无菌 PBS 或蒸熘水把冻干粉末状的 PMSG 稀释成 50 U/mL, 并分装成便于每只鼠注射 0.1 mL(5U) 的量, -20 °C 下储存, hCG 配制方法一样,避光-20 °C 储存;②注射激素:选择 5-8 周龄的健康 SPF 级雌鼠,第 1 天下午 3 点左右取出 PMSG, 解冻后每只小鼠腹腔注射 5U 的量。46-48 小时后(第 2 天下午 1-3 点)每只注射 hCG 5U。注射完 hCG 后,每只雌鼠与一只性成熟且配种性能良好的同系雄鼠合笼,第二天早晨检查雌鼠是否有交配形成的阴道栓,检查结果呈阳性的单独饲养,作为胚胎供体。


B. 胚胎的收集:以检查阴道栓为第 1 天,然后第 4 天上午(胚胎约处于桑葚胚时期)进行胚胎收集。用颈椎脱臼法处死胚胎供体鼠,用过氧乙酸浸泡后迅速放入灭过菌的超净工作台内,沿腹中线剪开小鼠的腹部,将小鼠的子宫连同约 1/2 的输卵管取出并放于盛有经过滤处理的 M2 培养基的培养皿内。用磨去针尖的 1 ml 注射器吸取 M2 培养基,从子宫的一头轻轻插入后推动注射器,将胚胎从子宫中冲洗出来。在体式显微镜下用自制的捡卵器(用一根长约 3 cm 、直径 0.5 cm 左右硬质玻璃管,一端拉成内径 150 µm 、外径 200 µm 的细端,接上一端乳胶管,再接上小注射器,构成简易捡卵器)将完整的胚胎在 M2 培养基液滴中连续洗 5 次后收集,放于 M16 培养基内备用。


(三)胚胎移植。

A. 将胚胎传入隔离器:将 M16 培养基内的胚胎在移植前用经双重过滤的 M2 培养基连续洗 5 次后,在显微镜下将胚胎装入毛细玻璃管中,在酒精灯火焰上迅速封闭玻璃管两端,于过氧乙酸溶液中浸泡 20 分钟后,通过一个盛有消毒液的有锁通道传入 Gustafsson 不锈钢制无菌隔离器(可安装体式显微镜)内进行移植手术。隔离器与外环境之间通过带锁且装有消毒液的通道连接,可通过它将物品传入隔离器的同时灭菌处理,从而保证隔离器内部的无菌环境。


B. 移植前假孕鼠的处理:胚胎准备好后,选择假孕 0.5-1 天的受体鼠,用 0.3% 戊巴比妥溶液,按 0.1 mL/10 g 的剂量腹腔注射,待麻醉后,减去背腰部位的毛,在两腰切开 1.5-2.0 cm 的切口,揪出卵巢和输卵管部,在输卵管膨大且血管少的部位用显微剪刀剪开一个小的口子,作为胚胎移植进入输卵管的入口。


C. 胚胎移植进入输卵管:在打开毛细玻璃管之前,用 0.01 mol/L NaOH 溶液冲洗以除去管壁上残留的过氧乙酸,然后用玻璃刀隔开玻璃管两端,用一个 10 mL 的注射器通过一段乳胶管与毛细玻璃管连接起来后,将毛细管的另一端轻轻插入输卵管的切口,缓缓推动注射器,将胚胎送入输卵管。一侧输卵管移植进入的胚胎数应根据小鼠的品种作调整,一般繁殖率高的小鼠移植的胚胎数也相应更多,但都应该大于该品种小鼠平均每胎的产仔数。


注意事项

移植完成后尽快缝合伤口,注意观察小鼠的怀孕情况。

来源:丁香实验

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