无菌小鼠代孕技术

无菌小鼠代孕技术的基本原理是以无菌小鼠（如昆明小鼠， KM)) 作为胚胎受体，将 SPF 级的相同或不同品系的小鼠（如 C57BL6/J) 作为胚胎供体，将胚胎收集后移植到无菌小鼠的输卵管中，受体经过妊娠，产下并哺育后代小鼠，从而获得与供体鼠同品种的无菌小鼠。

器材：

体式显微镜、无菌手术隔离器、 Gustafsson 不锈钢制无菌隔离器、高压灭菌锅、无菌小鼠饲养隔离器、传递桶、超净工作台等。

试剂：

①0.3% 戊巴比妥钠溶液 ;

②无菌 PBS 或蒸熘水 ;

③ PMSG；

④ hCG；

⑤ 过氧乙酸；

⑥ 过滤处理的 M2 培养基；

⑦ M16 培养基；

无菌小鼠代孕技术的基本过程可分为如下几步：

（一）受体鼠准备。

用作胚胎移植受体假孕鼠 (donor pseudopregnant females) 是通过用结扎输精管或遗传不育雄鼠交配自然发情母鼠来制备的。假孕受体鼠的制备包括以下过程：

A. 绝育雄鼠的制备：将具有良好配种记录的与受体鼠同系 (KM) 的雄鼠 (2 月龄以上），用 0.3% 戊巴比妥钠溶液按 1 mL/l00 g 的剂量腹腔注射，完全麻醉后，用剪刀在其腰腹部正中剪开一条约 2 cm 的横向切口，用钝头镊子将一侧睾丸拉出，找到输精管后用剪刀截去输精管的中间部分。两侧的输精管结扎 (vasectomy) 后将睾丸放回腹腔，缝合切口后单独饲养，注意保温。结扎恢复后至少要先进行 1 周的配种实验，确认公鼠不育且有见栓记录，才能用于正式实验。

B. 受体鼠与绝育雄鼠交配：受体母鼠 (receptor female) 至少应该在 6-8 周龄，体重不宜过大，将可用的绝育雄鼠与受体鼠于下午 17:00 左右按 1: 1 比例合笼（为了增加见栓率可按 1: 2 比例合笼），第二天早上检查阴栓，见栓后 0.5 天的假孕鼠用作胚胎输卵管部位移植的受体鼠。

（二）供体胚胎制备。

供体胚胎的制备是无菌小鼠代孕技术的关键部分，胚胎的好坏直接影响受体鼠的妊娠和产仔率。供体胚胎的制备过程主要包括供体鼠的超数排卵、胚胎的收集。

A. 供体鼠的超数排卵：①准备激素：注射前，用无菌 PBS 或蒸熘水把冻干粉末状的 PMSG 稀释成 50 U/mL, 并分装成便于每只鼠注射 0.1 mL(5U) 的量， -20 °C 下储存， hCG 配制方法一样，避光-20 °C 储存；②注射激素：选择 5-8 周龄的健康 SPF 级雌鼠，第 1 天下午 3 点左右取出 PMSG, 解冻后每只小鼠腹腔注射 5U 的量。46-48 小时后（第 2 天下午 1-3 点）每只注射 hCG 5U。注射完 hCG 后，每只雌鼠与一只性成熟且配种性能良好的同系雄鼠合笼，第二天早晨检查雌鼠是否有交配形成的阴道栓，检查结果呈阳性的单独饲养，作为胚胎供体。

B. 胚胎的收集：以检查阴道栓为第 1 天，然后第 4 天上午（胚胎约处于桑葚胚时期）进行胚胎收集。用颈椎脱臼法处死胚胎供体鼠，用过氧乙酸浸泡后迅速放入灭过菌的超净工作台内，沿腹中线剪开小鼠的腹部，将小鼠的子宫连同约 1/2 的输卵管取出并放于盛有经过滤处理的 M2 培养基的培养皿内。用磨去针尖的 1 ml 注射器吸取 M2 培养基，从子宫的一头轻轻插入后推动注射器，将胚胎从子宫中冲洗出来。在体式显微镜下用自制的捡卵器（用一根长约 3 cm 、直径 0.5 cm 左右硬质玻璃管，一端拉成内径 150 µm 、外径 200 µm 的细端，接上一端乳胶管，再接上小注射器，构成简易捡卵器）将完整的胚胎在 M2 培养基液滴中连续洗 5 次后收集，放于 M16 培养基内备用。

（三）胚胎移植。

A. 将胚胎传入隔离器：将 M16 培养基内的胚胎在移植前用经双重过滤的 M2 培养基连续洗 5 次后，在显微镜下将胚胎装入毛细玻璃管中，在酒精灯火焰上迅速封闭玻璃管两端，于过氧乙酸溶液中浸泡 20 分钟后，通过一个盛有消毒液的有锁通道传入 Gustafsson 不锈钢制无菌隔离器（可安装体式显微镜）内进行移植手术。隔离器与外环境之间通过带锁且装有消毒液的通道连接，可通过它将物品传入隔离器的同时灭菌处理，从而保证隔离器内部的无菌环境。

B. 移植前假孕鼠的处理：胚胎准备好后，选择假孕 0.5-1 天的受体鼠，用 0.3% 戊巴比妥溶液，按 0.1 mL/10 g 的剂量腹腔注射，待麻醉后，减去背腰部位的毛，在两腰切开 1.5-2.0 cm 的切口，揪出卵巢和输卵管部，在输卵管膨大且血管少的部位用显微剪刀剪开一个小的口子，作为胚胎移植进入输卵管的入口。

C. 胚胎移植进入输卵管：在打开毛细玻璃管之前，用 0.01 mol/L NaOH 溶液冲洗以除去管壁上残留的过氧乙酸，然后用玻璃刀隔开玻璃管两端，用一个 10 mL 的注射器通过一段乳胶管与毛细玻璃管连接起来后，将毛细管的另一端轻轻插入输卵管的切口，缓缓推动注射器，将胚胎送入输卵管。一侧输卵管移植进入的胚胎数应根据小鼠的品种作调整，一般繁殖率高的小鼠移植的胚胎数也相应更多，但都应该大于该品种小鼠平均每胎的产仔数。

移植完成后尽快缝合伤口，注意观察小鼠的怀孕情况。