FACSAria流式细胞仪无菌分选的基本流程

一、环境和液流的消毒

1、准备足量的无菌1×PBS（3L左右）和去离子水（10L左右）。PBS和去离子水可高压灭菌，sheath桶和装DI水的5L小桶依次用75％ 医用酒精和无菌去离子水各涮洗三次，然后将无菌PBS和去离子水分别注入相应桶内即可。

2、房间在分选前紫外灯照射15－20分钟；用1:50新洁尔灭拖地；用75％ 医用酒精擦拭工作台和收集架；用75％ 医用酒精喷洒分选细胞收集区和上样区。

二、开机和管道的消毒

1、将Sheath液换为活性氯浓度为0.5% 的次氯酸钠溶液（不要用75％ 的酒精），开机。开机前，先掀起流动室和分选室的罩盖，开启电源，打开计算机并等计算机进入WINDOWS系统后，打开激光电源，运行FACSDiva软件，联机成功后，执行Fluidics startup命令。

然后从FACSDiva的sort菜单进入sort setup，选择合适的液流压力（high、 middle、low）。一般来说，100 μm的喷嘴选用Low，而70 μm的喷嘴选用middle。

2、打开breakoff window，点击显示窗上的液流开关，检查液流是否正好流入废液槽中间和液流的形态是否正常。如果出现异常，可以通过调整喷嘴的位置，改变Breakoff 窗口的Amplitude的大小和打开Attenuation开关等来进行调整。（具体操作可参考Instrument User’s Guide的194－200页），直至液流形态和位置符合分选要求。

3、在上样管中装入1 ml 活性氯浓度为0.5% 的次氯酸钠溶液,将上样管放在上样架上，点击Acquisition窗口的Load开关，运行15－20分钟后，点击Unload开关，取下上样管。

4、将Sheath液换为无菌PBS，先后执行Fluidics shutdown和Fluidics startup程序各一次。

通过上述操作完成了环境和管道的消毒，为分选准备了无菌的环境，在后续的操作中应注意保持，以确保分选样本不被污染。

三、分选相关参数的调节

1、在side－stream window中，打开Voltage开关，确定在打开Voltage开关后，液流没有偏离中心位置，如果有偏离可以调整Voltage center，使其回到中间位置。

2、打开Test Sort，通过调整电压的大小来调整side stream的位置。让side stream能够正好落入收集管的相应位置中。

3、点击Browser中的Experiment图标，创立一个新的Experiment，并改名为Accudrop。

4、在Sheet或者Template中创立FSC图，并画一个可以包含所有Plot的gate。

5、打开Sort Layout，将Precision mode设置为purify，Target Events设置为continuous。

6、上一管装有Accudrop Beads的样品管。

7、调整速率，使获取速度为2000－4000events每秒。注意速率不要超过4。

8、点击打开Voltage，点击sort按钮，点击Optical Filter，调节drop delay，使屏幕左边的方框中的数值为98％ 以上，即调整好了drop delay。Drop delay是影响分选质和量的重要指标，一定要调整好。