【讨论】时间分辨荧光免疫技术
丁香园论坛
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大伙都来讨论下稀土元素在时间分辨荧光免疫技术的应用原理
我先说说
时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。
平时常用的稀土金属主要是Eu(铕）和Tb(铽），Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。
就拿铕吧
3价铕与双功能螯合剂如EDTA形成稳定的螯合物。
多氨基多羧基类螯合剂螯合剂；一边结合3价铕，一边与蛋白质(抗原或抗体)结合，常用的此类螯合剂有EDTA等。
聚氨基多羧酸酐与氨基芳香羧酸加合物这类螯合剂；一端是环状酸酐，可以和生物分子偶联，另一端是芳香羧酸，可以敏化稀土离子的荧光。常用的此类螯合剂有二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)等。
增强液-----一般由p一二酮体、三辛基氧化膦、TritonX一100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2．0—3．2)组成。酸性增强液使铕离子从螯合物中解离下来，游离的Eu“在三辛基氧化膦协同下，重新与B一二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，可发射极强的荧光信号。目前，增强液中使用的B一二酮体类螯合剂效果最佳的是B—NTA，其灵敏度可达16x10 mol铕。
蛋白质(抗原或抗体)的标记在TRFIA中，铕离子首先要作为标记物，标记到蛋白质(抗原或抗体)上。标记抗体(或抗原)需要有双功能基团的螯合剂，一侧基团与铕离子螯合，另一侧与抗体(或抗原)上的自由基团连接。抗原(抗体)上的自由基团主要是一NH和一COOH，双功能螯合剂应
能与一NH和一COOH相连。常用的有戊二醛、碳二亚胺(EDC)等。
双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个用Eu“标记，另一个包被固相载体，经过免疫反应形成免疫复合物后，再将铕离子从复合物上完全解离下来，在铕离子的增强液中与另一种螯合剂结合，在协同剂的作用下，形成一个铕离子包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团)。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号，其强弱与待测抗原(或抗体)含量相关。该法已用于下列成分的检测：HCG、促甲状腺素(TSH)、促滤泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、催乳素(PRL)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(ferritin)、p微球蛋白(BMG)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、免疫球蛋白(IgE)以及CAS0、CA19．9、CA242等。
固相抗体竞争法其原理是：限量固相抗体与Eu3标记抗原和样品中的待测抗原竞争性结合，样品中的抗原浓度越高，固相抗体结合的Eu“标记抗原量就越少，反之亦然。故固相抗体上的荧光信号强度与样品中的抗原浓度成反比。
双标记法在免疫分析中，常需要同时测定两种或两种以上的待测物。为达此目的，需用不同的稀土离子分别标记多种抗原。用于双标记的元素组合主要有铕和铽以及铕和钐(检测TSH、T等)。有学者同时利用铕、铽组合以及铕、钐组合检测血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)
标记靶细胞Eu”标记技术检测细胞功能，是Eu“标记的一种新的应用。它利用Eu”代替了同位素(cr)作为细胞标记物，灵敏度高，特异性好，测量时间短，可检出少量靶细胞的释放量，重复性好且标记靶细胞稳定。运用Eu“和rI’b“同时检测NK细胞的细胞毒性，步骤简单，整个分析可在一日内结束。
我先说说
时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是近十年发展起来的一测微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。
时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析的利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度的提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。
解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。
平时常用的稀土金属主要是Eu(铕）和Tb(铽），Eu荧光寿命1ms,在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。
由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。
就拿铕吧
3价铕与双功能螯合剂如EDTA形成稳定的螯合物。
多氨基多羧基类螯合剂螯合剂；一边结合3价铕，一边与蛋白质(抗原或抗体)结合，常用的此类螯合剂有EDTA等。
聚氨基多羧酸酐与氨基芳香羧酸加合物这类螯合剂；一端是环状酸酐，可以和生物分子偶联，另一端是芳香羧酸，可以敏化稀土离子的荧光。常用的此类螯合剂有二乙三胺五乙酸酐(DTPAA)等。
增强液-----一般由p一二酮体、三辛基氧化膦、TritonX一100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2．0—3．2)组成。酸性增强液使铕离子从螯合物中解离下来，游离的Eu“在三辛基氧化膦协同下，重新与B一二酮体形成一种新的能够高效率地接受激发光的螯合物。在激发光激发下，铕离子获能，经过电子跃迁并返回基态，可发射极强的荧光信号。目前，增强液中使用的B一二酮体类螯合剂效果最佳的是B—NTA，其灵敏度可达16x10 mol铕。
蛋白质(抗原或抗体)的标记在TRFIA中，铕离子首先要作为标记物，标记到蛋白质(抗原或抗体)上。标记抗体(或抗原)需要有双功能基团的螯合剂，一侧基团与铕离子螯合，另一侧与抗体(或抗原)上的自由基团连接。抗原(抗体)上的自由基团主要是一NH和一COOH，双功能螯合剂应
能与一NH和一COOH相连。常用的有戊二醛、碳二亚胺(EDC)等。
双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇的两个单克隆抗体，一个用Eu“标记，另一个包被固相载体，经过免疫反应形成免疫复合物后，再将铕离子从复合物上完全解离下来，在铕离子的增强液中与另一种螯合剂结合，在协同剂的作用下，形成一个铕离子包裹于其内部的微胶囊(胶态分子团)。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号，其强弱与待测抗原(或抗体)含量相关。该法已用于下列成分的检测：HCG、促甲状腺素(TSH)、促滤泡素(FSH)、促黄体生成素(LH)、催乳素(PRL)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(ferritin)、p微球蛋白(BMG)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、免疫球蛋白(IgE)以及CAS0、CA19．9、CA242等。
固相抗体竞争法其原理是：限量固相抗体与Eu3标记抗原和样品中的待测抗原竞争性结合，样品中的抗原浓度越高，固相抗体结合的Eu“标记抗原量就越少，反之亦然。故固相抗体上的荧光信号强度与样品中的抗原浓度成反比。
双标记法在免疫分析中，常需要同时测定两种或两种以上的待测物。为达此目的，需用不同的稀土离子分别标记多种抗原。用于双标记的元素组合主要有铕和铽以及铕和钐(检测TSH、T等)。有学者同时利用铕、铽组合以及铕、钐组合检测血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)
标记靶细胞Eu”标记技术检测细胞功能，是Eu“标记的一种新的应用。它利用Eu”代替了同位素(cr)作为细胞标记物，灵敏度高，特异性好，测量时间短，可检出少量靶细胞的释放量，重复性好且标记靶细胞稳定。运用Eu“和rI’b“同时检测NK细胞的细胞毒性，步骤简单，整个分析可在一日内结束。
