【心得】测序常见问题及分析
丁香园论坛
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总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！
Q:测序结果中为什么找不到引物序列?
A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧
光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；
找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光
燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物
的序列无法找到；
测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相
反的，这时就要反向互补查找引物；
测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所
以就找不到引物了；
存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?
A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配
我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的
相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?
A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；
②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好
地与模板结合；
③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上
有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯
度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；
④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，
荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标
记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误；
⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引
物最好是经过 PAGE 胶纯化的。
Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗？
A: 该方法可靠性不高，主要有以下两个原因。
①首先，并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如
果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和
突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在；
②其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比例较高时，也
不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果
进行处理时， 会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低， 以得到尽可能好的结果。 因此， 当某处出现双峰时，
测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体
的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。
Q:DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?
A:溶解DNA测序样品，用灭菌双蒸馏水最好。DNA 的测序反应也是 Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶
的反应条件。用缓冲液溶解在进行测序反应时，缓冲液的组份会影响到测序反应，条件，造成 Taq 酶的聚
合性能下降。
Q:测序结果中会出现双峰的现象，是什么原因造成的?
A:样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品
中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形；
样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模
板中有其他 DNA 的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳
无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况；
样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复
序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现 Two pattern 的情况；
所用的测序引物不纯， 这种情况一般发生在PCR产物测序中。 因为PCR测序一般使用的都是PCR扩增引物，
如果引物本身不纯，测序结果会出现双峰。所以我们测序的引物一般要求都是要经过 PAGE 纯化的；
测序样品序列中存在如重复序列，poly 结构，发夹结构等复杂结构导致测序信号出现乱峰。
Q:DNA片段过长，一个反应测不通怎么办?
A: 从两端同时测序，然后拼接；如果两端同时测序还是没通，这时可以在原测序结果上合适区域设计引
物步行测序，测通后拼接即可。
Q:过短的PCR 产物为什么不适于直接测序？
A:①首先，过短的 PCR产物纯化困难，一般的 PCR 产物纯化试剂盒都要求 PCR 产物片段大于 150bp，过短
的 PCR 产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的 PCR 产物一般不低于 150bp长度。
②其次，由于测序本身的限制，以一个 100bp的 PCR 产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约 40 到
50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过 30～40 碱基。这么少的序
列很难向客户收费。因此，过短的 PCR 产物，只能克隆后进行测序。
Q: 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？
A:①在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上
给出的信号往往是比较强的一个信号。 所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的， 请在测序订单上注明，
我们在修改报告时会加以注意。
②如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出
现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少，信号强度不足以被检查到。
Q:我的基因序列与标准序列为什么有差别？
A: 一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在 PCR
扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI 公
司承诺其仪器的测序精度并没有达到 100%。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错
误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到
您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。
Q:测序结果中为什么找不到引物序列?
A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧
光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；
找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光
燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物
的序列无法找到；
测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相
反的，这时就要反向互补查找引物；
测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所
以就找不到引物了；
存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?
A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配
我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的
相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?
A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；
②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好
地与模板结合；
③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上
有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯
度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；
④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，
荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标
记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误；
⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引
物最好是经过 PAGE 胶纯化的。
Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗？
A: 该方法可靠性不高，主要有以下两个原因。
①首先，并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如
果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和
突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在；
②其次，在同一位置，不同碱基的信号强渡一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比例较高时，也
不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果
进行处理时， 会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低， 以得到尽可能好的结果。 因此， 当某处出现双峰时，
测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体
的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。
Q:DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?
A:溶解DNA测序样品，用灭菌双蒸馏水最好。DNA 的测序反应也是 Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶
的反应条件。用缓冲液溶解在进行测序反应时，缓冲液的组份会影响到测序反应，条件，造成 Taq 酶的聚
合性能下降。
Q:测序结果中会出现双峰的现象，是什么原因造成的?
A:样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品
中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形；
样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模
板中有其他 DNA 的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳
无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况；
样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复
序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现 Two pattern 的情况；
所用的测序引物不纯， 这种情况一般发生在PCR产物测序中。 因为PCR测序一般使用的都是PCR扩增引物，
如果引物本身不纯，测序结果会出现双峰。所以我们测序的引物一般要求都是要经过 PAGE 纯化的；
测序样品序列中存在如重复序列，poly 结构，发夹结构等复杂结构导致测序信号出现乱峰。
Q:DNA片段过长，一个反应测不通怎么办?
A: 从两端同时测序，然后拼接；如果两端同时测序还是没通，这时可以在原测序结果上合适区域设计引
物步行测序，测通后拼接即可。
Q:过短的PCR 产物为什么不适于直接测序？
A:①首先，过短的 PCR产物纯化困难，一般的 PCR 产物纯化试剂盒都要求 PCR 产物片段大于 150bp，过短
的 PCR 产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的 PCR 产物一般不低于 150bp长度。
②其次，由于测序本身的限制，以一个 100bp的 PCR 产物用于测序为例，去掉两个引物的序列大约 40 到
50bp，再加上测序起始端的一些读不出的碱基，真正能够得到的有用序列不过 30～40 碱基。这么少的序
列很难向客户收费。因此，过短的 PCR 产物，只能克隆后进行测序。
Q: 我的样品上有一个杂合位点，为什么在你们的报告上看不到杂合的信号？
A:①在检查报告时，设备和我们的技术员都倾向于提供给客户一个单一的信号，所以在出现杂合的位置上
给出的信号往往是比较强的一个信号。 所以如果您的PCR样品上是存在杂合位点的， 请在测序订单上注明，
我们在修改报告时会加以注意。
②如果在您预期出现杂合信号的位置上只有单一的信号，那么我们是不会人为将其修改为杂合位点的。出
现这样的情况可能是在您的样品中杂合成份太少，信号强度不足以被检查到。
Q:我的基因序列与标准序列为什么有差别？
A: 一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在 PCR
扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI 公
司承诺其仪器的测序精度并没有达到 100%。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错
误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到
您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。
