测序常见问题及其分析(图)
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1、PCR 产物测序时出现重叠峰
问题图1【模板中有碱基缺失,往往是单一位点(1-1)或两个位点(1-2)碱基缺失导致测序结果移码】
图1-1
解决方法:将PCR产物克隆到质粒(如T载体)中挑单克隆测序,或将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序。
问题图2(PCR产物不纯,含部分序列一致的两种以上的片段,长度不一)
解决方法:主要原因是PCR产物没有纯化,含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段,将PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化)后再进行测序,便可解决。
问题图3(测序引物有碱基缺失)
图3
测序引物有碱基缺失(一般是引物的5'''端缺失),和模板的碱基缺失即图1有些类似,所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码,而引物碱基缺失的话,则从测序一开始就出现移码,表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。
解决方法:重新合成引物,或将引物进行PAGE纯化。