测序常见问题分析

1.如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA ，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA ，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA 。

2.怎样溶解引物？

我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

3.合成的引物应如何保存?

没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。

4.如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。

加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?

没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。

6.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?

2) 引物本身是否有立体结构.

3) PCR反应用试剂是否能正常工作?

4) PCR仪是否工作正常?

5) PCR反应条件是否合适?

如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。

7.测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8，引物的纯度合格吗?

由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。

而合成的DNA /RNA 则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同， 例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

8.上海生工公司可以合成多长的序列？

由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要，我们愿意接受110碱基以下的订单。

9.PCR产物经过以后测序 发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？

我们认为这多数是PCR过程和过程中引入的错误。遇到这种情况，请您：

1) 可以要求我们重新免费合成引物。

2) 重新挑取克隆 测序 ，会有找到正确的可能.

10.如何将两条互补的单链退火形成双链？

用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

11.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?

对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。

12.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA 分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA 进行定量。

13.2OD的引物可以多少做次PCR反应？

一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。

14. DNA 合成粗产物中含有什么杂质？

DNA 合成仪合成的粗产物，其中除了含有所需的目的DNA 片段以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段以及脱保护基团产生的铵盐，本公司提供的引物已全部通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。

15.引物在常温下运输，会降解吗？

不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

16.为何长链引物的收费要比短链引物要高？

通常在合成长链引物时，试剂的加入量要比短链引物要多很多，尤其是大于90bp的碱基以上的引物，由于成本的增加，从而导致价格也要高一些。