测序常见问题分析
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1.如何测定引物的OD值?
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。
举例:您拿到一管干粉的DNA ,用1ml水溶解成母液,取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25,说明该50μL中含有0.25OD的DNA ,也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA 。
2.怎样溶解引物?
我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。
3.合成的引物应如何保存?
没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数份保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液(10 pmol/ml或20 pmol/ml)后进行实验。
4.如何检测引物的纯度?
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。
5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?
没有,5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,订货时请特别注明,此时需收取磷酸化的费用。
6.合成的引物进行PCR反应时无目的带,怎么办?
PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。
1) 引物和模板是否配对,同源性有多大?
2) 引物本身是否有立体结构.
3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
4) PCR仪是否工作正常?
5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。
7.测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8,引物的纯度合格吗?
由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。
而合成的DNA /RNA 则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同, 例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.
8.上海生工公司可以合成多长的序列?
由于用户和基因拼接的要求,我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要,我们愿意接受110碱基以下的订单。