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【交流】测序常见问题分析

丁香园

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<font>打开峰图文件,依据图形初步判定测序质量,SAP酶纯化后的头峰杂度比较大,至少前50bp序列一般不可信,后续峰形如果还不错,主峰高、噪峰低、未见干扰峰,测序结果应该可信。一个正常的成功反应,能保证测序峰形清晰的长度为500 Bases (实际600 —800 Bases)。<br /> 在进行DNA测序时,紧接引物的10 — 30 Bases有时不一定能完全读清楚。 由于DNA结构上的原因,有时会出现反应中途无法进行之情况。如:G/C rich; G/C Cluster;Poly A、 Poly T的连续结构等。此外,另一种情况为反应中途出现的套峰现象,此种情况一般为DNA结构中的重复序列,造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下:<br /> <font><strong>1<strong>: 测序结果有很多套峰,出现很多N值</strong></strong></font><font>原因分析:</font><font>PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。 </font><font>在序列的起始端出现N值,主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰,是机器无法正确判读出位何值。有时,引物二聚体或者起始端小片段的丢失,也会出现N值。</font><font>模版本身含杂合序列,有等位基因。</font><br /> <font><strong>2:为什么找不到我的PCR引物序列?</strong></font><font>用PCR引物作为测序引物,所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的,所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序,得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中,由于通用引物与插入序列有一段距离,就可以测出您的引物序列。</font><br /> <font><strong>3:测序结果和文献资料不一样,为什么?</strong></font><font>原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致。</font><br /> <font><font><strong>4:过短的PCR产物为什么不适于直接测序?</strong>首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化;再者,测序的前50bp和后50bp的序列是不好的,所以不适于直接测序。<br /> <strong>5:酒精如果没有挥发完全,在约300bp处会出现连续异常的G峰,酒精挥发时间过长会导致DNA断裂。</strong></font></font></font>

<font>第一个峰,重叠干扰。如果不判读为干扰峰,那就说明样品不纯,如果是基因组DNA,就很好地说明了样品为杂合子,该位点可能存在SNP现象(T/G)。如果判读为干扰峰,我们只需认定样品此处碱基为T为行了。<br /> <strong>第二个峰,错位干扰。如果不判读为干扰峰,则说明样本可能比预期多一个碱基(G),如果判读为干扰峰,我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。<br /> 6:为什么用PCR产物或质粒测序时,经常会出现套峰现象?(1) 下图是pGEM-T载体测序的结果,在83位点处测序结果出现双峰,即模板中含有两个或两个以上的相同载体,但是插入片段不同。 解决办法:重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是,重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段,并不足以证明模板的单一。</strong></font>



<font>(2)对于PCR产物也同样有模板不单一的情况,如下图所示,<font><strong>在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰,且在197bp位置有一个高高的A峰,这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。</strong></font><font><strong>解决方法:对PCR产物切胶纯化,再进行测序。</strong></font><br /> <font><strong>7:poly结构的测序结果<br /> </strong></font></font>


<font><font>以polyT为例,在polyA/T结构之后往往出现移码现象,而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。</font><font>解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly结构处,即可完成模板全长的拼接。</font></font>
以上内容,从以下地址摘取:
http://www.seq.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=5010&extra=
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