【分享】BSP,MSP引物设计

进入丁香园，是从做MSP开始的。从对DNA甲基化的一无所知到MSP实验成功，经历了很多艰难，同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以看出，近几年来，国内对DNA甲基化的研究在逐年增加，战友们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对MSP,及BSP的一点体会，希望能对新手们有所帮助，也请老手们批评补充。

亚硫酸氢盐转化和PCR扩增是MSP,BSP的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化，估计现在做手工修饰的也不多了，试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但PCR中的引物设计，现在可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是来源于文献的，但事实上在很多情况下，我们是没法找到现存引物的，因此掌握BSP,MSP引物的设计就显得非常必要了。

BSP，MSP引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降低，而且经常产生T或G或者富含GC片段交替出现的序列。这个会使引物选择变得困难。因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。BSP,MSP引物的设计，除了要遵循引物设计的基本原则外，还要注意一下一些规则：
（1）引物结合位点应该在原始序列中包含4个以上胞嘧啶来确保转化后的DNA的特异性。
（2）BSP引物不应包含CG二核苷酸，长度在25－30bp较为合适；MSP引物因为往往具有较高的GC比，长度应适当缩短。
（3）扩增片段一般认为不要超过650bp，以保证PCR的效率。
（4）对于MSP引物，应该包含3－5个潜在可甲基化位点，且引物的3端应该是一个潜在的可甲基化胞嘧啶，以得到最大化的特异性。
（5）MSP中，U引物与M引物应该具有接近的TM值。

一些网站提供了BSP,MSP引物的免费设计服务，本人也尝试在网上设计过，感觉里面算法过于简单，无法得到满意的引物。在实验中，本人采用了premier5设计的引物。具体做法如下：
（1）获取感兴趣的启动子序列，将序列中非CG二核苷酸的C全部转化为T（word可实现此功能）；
（2）序列载入premier5，按上述原则筛选引物。
（3）MSP引物中的一条往往是由需要确定，因此我们可以直接利用premier5筛选其互补引物。
MSP引物要求的苛刻性常常使得引物的设计变得不可能，在满足规则（4）的情况下，可设计外侧BSP引物，利用BSP产物进行MSP.

BSP,MSP引物设计的另一个困难在于无法进行全基因组的blast，这也让巢式扩增显得更加必要。