【分享】snp 试验中注意的手法问题（菜鸟的经验，菜鸟参考，高手拍砖）

realtime 做snp，对一些新手来说，也许在众多影响因素中，手法问题是一个比较常见的问题，本人属于初级菜鸟，在实验室才呆 不到3月，实验做了才不到半月，realtime做snp已经做了10板左右（96孔板），仅仅从图像上看，结果不满意者十有六七，主要的问题在于1:）荧光曲线起步没在起点，也就是说起点不整齐，线比较乱事业个问题。2）就是荧光曲线太平直，也就是说一些实验做的也许根本就没产物生成，虽说分型有，但是再重复做，有时另一个基因型，就是重复行不好。3）分型图的个基因型太乱，没有完全明显的分开，即给人的视觉效果很糟糕。

本着这些问题，小弟我塌上了艰困的寻求原因的道路，丁香园是个不可缺少的途径，在丁香园里，看了很多高手同仁的经验之谈，又无意中看到了rt-pcr的讨论群，加入了，和大家一起讨论，得出了一些参考答案：1）首先考虑引物，探针的设计是否有问题？我的银武士基康公司设计和合成的，我们实验室（借用上海一家的）里的很多师兄，师姐很多都是这公司的，还发过SCI5分的文章，合作长久，我也在BLAST上验证过（仅次于引物）

没问题，合格，师兄们说用就行，没问题，保险起见，又跑了下胶，有目条带，大小与产物大小一致，这个基本排除。2）关于条件的问题：按说每一个基因的snp都应该有属于他们自己的最 优化条件，这个问题师兄（SCI5分的那个）告诉我，大家做snp的，都是这个条件，无需优化，虽说不是最佳，但是结果一直还不错，大家都用这个，他们多位点的SNP也是这个条件，所以我也用了，但是图像基本合格的就十有2,3，这个也许是我手法问题，下一个问题讨论，我老板让他把我的标本，从头做了一板，虽说结果很多UNKNOWN的，但是荧光曲线是跑起来了，有产物了，线的起点也在一起，比较整齐，说明这个条件可以，排除。3）标本问题，这个一开是我也想到了，哪去测下OD值，在260nm处有峰值，说明标本合格，排除。4)剩下的，就是我的问题了，手法生疏，细节可能有失误，导致实验结果图形不好，结果的重复性不好。这个起初我我还比以为然，因为我都是按照他们告诉的方法做，比如取标本，融冰，配体系，加样，封膜，离心，不敢分心呀，可是结果就是有差距，无奈，不得不承认是这个问题，和我同学讨论，最后得出结果很大原因也是手法的问题。因为作为菜鸟的我，虽说在实验室2月多了，但是根本没怎么做过，因为没有自己的试剂那时，标本还没整理好，所以只是出于学习，观摩阶段，学了几次，仅仅新手做了一板，当时结果不太会看，就知道结果出来不少，之，后就回去看文献了，所以手法还是生疏，手易抖，我用另一只手扶住加样，加样的时间也长些，有时候也许枪头的样本没打完，就扔了，也可能是导致很多UNKNOWN的原因。

写到现在，是我这个菜鸟的初期经历，也是我第一次些了这么多，毕竟我刚接触实验，我本是临床型大夫，些了这么多，希望菜鸟能悟出些什么，希望高手拍砖，指正。接下了我再根据以上的指导改正实验，有什么心的发现，继续大家分享。都多支持呀，写这么多，很不易了呵呵。