Real-time qPCR 手册——手把手教你从菜鸟到高手
丁香实验团队
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由于 Real-time qPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验，也基本上被 real-time qPCR 所代替。由于 real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测，很多没有做过 real-time qPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从 real-time qPCR 的发展史说起，包括 real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！
一、Real-time qPCR发展史
Real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在 Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量 PCR 仪的发展起了至关重要的作用。1995 年，美国 PE 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制了 Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量 PCR 仪有 ABI7000、7300、7500，7700、7900 HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@ 和BIOER的LineGene 系列。
随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。
二、Real-time qPCR 概述
1. Real-time qPCR 原理
实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。
2. Real-time qPCR 的数学原理
首先来看一个r eal-time qPCR 中的重要参数 Ct 值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数。所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量成反比呢？我们来看 PCR 的扩增方程：
从线性方程上看，斜率（slope）为 -1/lg(1+E)，所以 E = 10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲PCR扩增效率在 90%-110% 都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于 PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100% 可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3. Real-time qPCR 的种类
根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如 SYBR@Green I 或者特殊设计的引物(如 LUX @Primers ) 通过荧光染料来指示产物的增加。
3.1 Taqman@探针法
Taqman@探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
3.2 分子信标法
分子信标：一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。
3.3 SYBR@Green 法
SYBR @Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR @Green I 的最大吸收波长约为 497 nm，发射波长最大约为 520 nm。在PCR反应体系中，加入过量 SYBR @Green 荧光染料，SYBR @Green 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
3.4 LUX @Primers 法
LUX @ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3』端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。
4. Real-time qPCR 和常规 PCR 的区别
实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测
敏感性高
需要样品少
特异性高
精确定量
三、Real-time qPCR 实验设计
实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个 real-time qPCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。
1. 实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免 RNA 的降解（尤其对于绝对定量的样品）。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类的样品储存液 ，比如百泰克的 RNAfixer 。
2. 引物设计
一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则：
扩增产物长度在 80-150 bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在 15-30 碱基之间。
G + C 含量在 40%-60% 之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5』端可以修饰。
引物3』端不可修饰。
引物3』端要避开密码子的第3位。
Taqman @ 探针的设计稍有不同，一般有公司设计合成。遵循下面以下原则：
尽量靠在上游引物；
长度 30-45 bp，Tm 比引物高至少 5 ℃；
5』端不要是 G，G 会有淬灭作用，影响定量
四、Real-time qPCR 操作过程
1. RNA 提取和反转录
在抽提 RNA 过程中任一环节的不正确操作都可能导致 RNA 酶的污染。由于 RNA 酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：
1. 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用 RNA 探针的实验室可能用 RNA 酶 A 或 T1 来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含 RNA 酶。
3. 在提取裂解液中，RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150 °C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行 RNA 的提取。
2. Mix 配制
一般来讲，进行 real-time qPCR MasterMix 都是 2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于 real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于 Ct 相差较多或者 SD 太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为 100-400 mM；模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500，如果 cDNA，通常情况下是 1 ul或者 1 ul的 10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用 MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：
1. MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制 Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少 3 个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是 ROXTM （现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测 PCR 产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把 ROXTM 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加 ROXTM 染料校正。
通常来讲，real-time qPCR 的反应程序不需要像常规的 PCR 那样，要变性、退火、延伸 3 步。由于其产物长度在 80-150 bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR @Green 等染料法，最好在 PCR 扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne 为例，详细看一下反应设置：
A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为「BioTeke」，进行「定量」实验。
B. 实验方法的选择：我们选用的比较 Ct 的 SYBR Green 方法， Fast 程序，以 cDNA 为模板进行。
C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置：PCR 反应程序的设置要根据不同公司的 MasterMix。比如 BioTeke 的95 ℃ 2 分钟就可以激活 DNA 聚合酶（ABI 的需要 10 分钟）。循环反应是 95 ℃ 15 秒，60 ℃ 15 秒的 40 个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置：
A-G 这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点 ABI 仪器需要加 ROX 参比染料，默认的是 ROX。有些公司是把 ROX 或者其他染料配制在 MasteMix 里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的 MasterMix 进行这一个步骤的选择。BioTeke 的 MasterMix 里没有参比染料，所以选择「none」。
设置好之后，就可以把配置好的 PCR 管放进仪器，点击 RUN！
五、Real-time qPCR 数据分析
1. Real-time qPCR 常见参数
基线（baseline）
通常是 3-15 个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold）
自动设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct 值: 与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取 Ct : 15-35 。太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn 是 Rn 扣除基线后得到的标准化结果（△Rn = Rn - 基线）。
2. 影响 Ct 值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定 Ct 的最主要因素。控制在一个合适范围内，使 Ct 在 15-35 之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的 pH 值和盐浓度。
PCR 反应的效率
PCR 反应的效率也会影响 Ct 值。在 PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与 PCR 扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR 效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110% 之间都是可以接受的。
3. 如何评估实时定量 PCR 反应的效果
PCR 扩增效率：
为了正确地评估 PCR 扩增效率，至少需要做 3 次平行重复，至少做 5 个数量级倍数 (5 logs) 连续梯度稀释模板浓度。
R2 值：
另一个评估 PCR 效率的关键参数是相关系数 R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果 R2 等于 1，那么你可以用 Y 值（Ct）来准确预测X值（量）。如果 R2 等于 0，你就不能通过 Y 值来预测 X 值。R2 值大于 0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。
精确度:
标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果 PCR 反应效率是 100%，那么 2 倍稀释点之间的平均 Ct 间隔应该恰为 1 个 Ct 值。要以 99.7% 的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于 0.167。标准偏差越大，分辨 2 倍稀释的能力就越低。为了能够在 95% 以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于 0.250。
灵敏度：
无论 CT 绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限。PCR 效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约 37% 不含有拷贝，仅有约 37% 含有1个拷贝，约 18% 实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。 评价荧光 PCR 结果的标准因素 建议 指标
效率 5 个数量级梯度稀释 Slope ～ -3.3 R2 > 0.99
精密度 至少 3 个重复 标准差 < 0.25（0.5 或者 1 个 Ct 之内）灵敏度 增加低浓度样本的重复数 统计分析
除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照（如无模板对照，无 反转录酶对照等）以及模板质量。
3. Real-time qPCR 定量方法
可以分绝对定量和相对定量。绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒 DNA，体外转录的 RNA，或者是体外合成的 ssDNA。相对定量可以分比较 Ct 法和其他一些相对方法。比较 Ct 指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异, 也称之是 2-△△Ct。
3.1 绝对定量
3.2 2-△△Ct 定量
3.3 其他定量方法
Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005
六、Real-Time qPCR常见问题分析
1. 无 Ct 值出现
检测荧光信号的步骤有误: 一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解: 可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2. Ct 值出现过晚（Ct > 38）
扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR 产物太长: 一般采用 80-150 bp 的产物长度。
3. 标准曲线线性关系不佳
加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物，或模板浓度过高
4. 负对照有信号
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5. 溶解曲线不止一个主峰
引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
6. 扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有 PCR 反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
如果扩增效率在 90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
8. 扩增曲线的异常？比如「S」型曲线？
参比染料设定不正确 (MasterMix 不加参比染料时，选 NONE)
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
