qPCR：从菜鸟到高手进阶宝典
生物学霸
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一、无 Ct 值出现
检测荧光信号的步骤有误：一般 SG 法采用 72℃ 延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解：避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
二、Ct 值出现过晚（Ct >38）
扩增效率低：反应条件不够优化。设计更好的引物或探针，改用三步法进行反应。适当降低退火温度，增加镁离子浓度等。
PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR 产物太长： 一般采用 80-150 bp 的产物长度。
三、Ct 值比较靠后
Ct 值比较靠后，对实验有一定的影响，因为经过那么多次的循环，酶的活性有可能有所下降，这时候扩增效率会有所改变（而定量 PCR 的理论基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值）。因此最好能够把 Ct 值往前移。解决办法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。
四、标准曲线的 slope 总大于４，每个梯度的平行 Ct 值差别大
这个斜率是＝1/LOG 10（扩增效率），理论上扩增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理，酶活是否正常，试剂盒的质量是否有保证。只有在引物和模板处于最适比例时才能得到比较满意的扩增效率，因此通过调节 PCR 反应体系中的引物终浓度来解决，可以做一些引物梯度来比较。
平行管的 Ct 值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致 Ct 值差别比较大。
五、ROX 染料是什么作用？
ROX 的作用 ABI 宣称是用来校准加样误差的。但是据说 ROX 的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到 CCD 的时候，走过的光程是不一样的，这样在 CCD 上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用 ROX 来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。
六、如何确定荧光定量 PCR 的基线
基线就是背景值，因此就是曲线在没有「起跳」之前的一段。在软件上有一个地方可以输入 baseline 从第几到第几 cycle 作为基线。设置原则是使没有起跳之前最多的 cycle 的信号接近 0。
七、引物和探针对 Ct 值有什么影响
首先要保证引物能够跟模板完全配对，第二，引物应该是过量的。第三，引物不应该形成引物二聚体。也说白了就是要保证体系的扩增效率尽量地达到 2 并且没有非特异性扩增。在保证这个前提之下引物对 Ct 值是没有影响的。
如果第一和第二没有达到，应该 Ct 值会变大。如果第三没有达到那么 Ct 值应该变小。探针应该与模板完全配对，并且有一定的长度，浓度过量。保证探针能够特异性地完全结合在模板上。
