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Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手

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3.3 SYBR@Green 法

SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR@Green 荧光染料,SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。


3.4 LUX@Primers法

LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在有目标片断的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号。

4. Real-time qPCR和常规PCR的区别

实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测

敏感性高

需要样品少

特异性高

精确定量

三、Real-time qPCR实验设计

实验设计其实比实验本身更重要!好的实验设计可以事半功倍,节省时间!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。对于一个real-time qPCR而言,首先就是实验材料的处理和准备;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%;进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。

1. 实验材料的处理和准备

以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。

一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。现在新技术的发展,也有一些非液氮类的样品储存液 ,比如百泰克的RNAfixer 。

2. 引物设计

一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则:

扩增产物长度在80-150bp。

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

产物不能形成二级结构。

产物长度一般在15-30碱基之间。

G+C含量在40%-60%之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物5’端可以修饰。

引物3’端不可修饰。

引物3’端要避开密码子的第3位。

Taqman@探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。遵循下面以下原则:

尽量靠在上游引物;

长度30-45bp,Tm比引物高至少5℃;

5’端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量

四、Real-time qPCR操作过程

1. RNA提取和反转录

在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则:

(1)全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

(2)使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。

(3)在提取裂解液中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。

当然,这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头,新过滤的超纯水,进行RNA的提取。

2. Mix配制

一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。

由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:

(1)MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

(2)更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

(3)每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

(4)所有成分加完后,离心去除气泡。

(5)每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(现在已经是ABI的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。

参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡,校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。

3. 仪器设置

所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。我们以 ABI StepOne为例,详细看一下反应设置:

A. 首先是实验目的选择:定量还是其他。我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。

B. 实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA为模板进行。

C. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置:包括哪个是实验组,哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。

E. 对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备

F. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分钟)。循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。

G. 反应体系的设置:

A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN!

五、Real-time qPCR数据分析

1. Real-time qPCR常见参数

基线(baseline)

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

阈值(threshold)

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。

2. 影响Ct值的关键因素

模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间

反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。

PCR反应的效率

PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCR扩增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来,反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3. 如何评估实时定量PCR反应的效果

PCR扩增效率:为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2,它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)来准确预测X值(量)。如果R2等于0,你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时,两个数值之间相关的可信度很好。

标准偏差(standard deviation,偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。

如果许多数据点都靠近平均值,那么标准偏差就小;如果许多数据点都远离平均值,则标准偏差就大。实际上,足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明,独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%,那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度,标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大,分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释,标准偏差必须小于等于 0.250


3.3 SYBR@Green 法
SYBR@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料,与双链DNA结合后,其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR@Green I 的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR@Green 荧光染料,SYBR@Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR@Green 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

 


3.4 LUX@Primers法
LUX@ (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。在有目标片断的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号。

 


4.  Real-time qPCR和常规PCR的区别
实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测
敏感性高
需要样品少
特异性高
精确定量

三、Real-time qPCR实验设计
实验设计其实比实验本身更重要!好的实验设计可以事半功倍,节省时间!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。对于一个real-time qPCR而言,首先就是实验材料的处理和准备;然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%;进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。

1.  实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。现在新技术的发展,也有一些非液氮类的样品储存液 ,比如百泰克的RNAfixer 。

2.  引物设计
一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则:
扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。遵循下面以下原则:
尽量靠在上游引物;
长度30-45bp,Tm比引物高至少5℃;
5’端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量

四、Real-time qPCR操作过程

1.  RNA提取和反转录
在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则:

(1)全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

(2)使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。

(3)在提取裂解液中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然,这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头,新过滤的超纯水,进行RNA的提取。

2.  Mix配制
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:

(1)MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。

(2)更多的配制Mix进行,减少加样误差。最好能在冰上操作。

(3)每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!

(4)所有成分加完后,离心去除气泡。

(5)每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(现在已经是ABI的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡,校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。

通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。

3.  仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。我们以 ABI StepOne为例,详细看一下反应设置:
A. 首先是实验目的选择:定量还是其他。我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置:包括哪个是实验组,哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分钟)。循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。
G. 反应体系的设置:

A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN!

五、Real-time qPCR数据分析
1.  Real-time qPCR常见参数

基线(baseline)
通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值(threshold)
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn:△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。

2.  影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCR扩增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来,反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3.  如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率:为了正确地评估PCR扩增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

 

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2,它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)来准确预测X值(量)。如果R2等于0,你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时,两个数值之间相关的可信度很好。
 

标准偏差(standard deviation,偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值,那么标准偏差就小;如果许多数据点都远离平均值,则标准偏差就大。实际上,足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明,独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%,那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度,标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大,分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释,标准偏差必须小于等于 0.250。

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