【原创】酵母双杂交 实验流程问题 请多指教 ！

我上个月做了 mating （酵母双杂交的一种办法）。
现在已经做到了，X-gal assay。
从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。

What can I do for it NEXT~

我的具体步骤是。

一 ：文库建立

1. mammalian cell total RNA --> Poly A RNA --> dsRNA --> 提纯 dsRNA。
2. 将提纯的dsRNA 转染到AH109细胞株,涂在 150ㅠ待 3~5天克隆出现 并长势饱满.
3. 每个150ㅠ， 放入5ml freezing media ，将细胞收集在一起，均匀混合，1ml 分装， -70度保存。

二 ：酵母双杂交

1 . mating , mating product 分别涂在 40个 TDO（SD/-H -L -T）， 10个 QDO( SD/-A-H-L-T) 。
2 . mating efficiency 3% 大于下限值2%。
3 . 实验步骤说明上，说3-8天克隆会出现。可是我的 大概 12天才长了出来（TDO）。
小心的将 TDO上长出来的 280个克隆，转移到TDO。
　再次培养了４天左右　 发现　21个在转移后没有继续长，所以淘汰掉。
４．将TDO上的克隆，转移到　QDO　（for strong interaction assay ）／　牙签上　剩下的一点点细胞　划在了100ㅠ的TDO(for colony X-a-gal filter assay) 。　双重选择，在QDO上生长，并在X-a-gal筛选中变蓝的克隆。
5. 以上方法，选出223个在　QDO　上生长的克隆。
6. X-a-gal filter assay 两次。　

到这里　问题出来了　从230多个克隆里 第一次选出了68个蓝色克隆。
第二次 挑选出了74个蓝色克隆。
可是，对比发现重复变蓝的只有 11个。
而且，书上说　X-a-gal filter assay最多不要超过８小时。
可是我的克隆，基本都是在６－８小时之间　变蓝的。

请大家　一起分析一下，怎么两次　X-a-gal filter assay　变蓝的差距这么大。
难道，都是假阳性？？

我首先将两次实验重合的　11个克隆的　plasmid DNA 提了出来，正在测序。

剩下的怎么办？　11个也太少了，之后的实验，怎么办？　有必要　再作一次　X-a-gal filter assay么？？　要是，又发生么变化，怎么办？？

拜托各位！！　！