[分享]如何选择凝胶
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2505
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当目标蛋白的物理特性如分子量、等电点等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同pH缓冲液的试管中，可简单地测出pI, 并确定纯化用缓冲液的最佳pH。
选择层析方法
在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。
二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。
三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
纯化大量粗品
处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE截止，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一，提高回收率，缩短纯化周期。
纯化硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，先用HiTrap HIC Test Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其他吸附性层析。
纯化糖类分子
固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等的凝集素，结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组分、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，可俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
纯化膜蛋白
膜蛋白分离长使用去污剂使其保持活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白电荷相反者，以避免在作离子交换时蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可用疏水层析法除去。
纯化单抗、抗原
单抗多为IgG，来源主要是腹水和混合瘤培养上清夜。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步醇化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的栽量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose Hp或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
疏水层析pheny1 Sepharose HP也很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来从蛋清里纯化IgY，结合量达100 mg纯IgY。
纯化重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融化入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合作粗分离。
纯化包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或尿素中。高化学稳定性的Sepharose12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白质需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以使1M NaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收效率明显提高。
包涵体蛋白固相复性
将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白聚体的形成，所以复性锝率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组胺酸融合蛋白；以及以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用。
纯化中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。传统中药多是前熬后服用，有效成分多为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合地利用多种层析方法，如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛选功能，例如，用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内酯、萜类、甾类等。
生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常相似的生物碱。相反，黄酮、醌类、皂甙、有机酸等可溶预溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
一般多糖纯化大多使用分子筛，如Sephadex，Sephacry1。若分子量在60万以下，并需更高等分辨率，可选择新一代的Superdex。一种植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组分纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。 SURCE 5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SURCE反相层析可用范围为PH1-14，并可用1M NaOH、1M HCI清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
纯化肽类
肽类的来源有天然萃取、合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可以从有机溶剂或促溶剂中复性，所以以高选择性的反相层析如Sephasil 、PepRPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析作出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。
纯化核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。
纯化寡核苷酸
寡核苷酸多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等的研究。合成后含三苯甲基的寡聚核苷酸译音离子、以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可去除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
脱盐、小分子去处
使用凝胶过滤介质Sephadex G10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting(5ml)可用针筒操作。HiTrap Desalting(26ml)可在数分钟为多至10 ml样品脱盐。
疫苗纯化
使用凝胶过滤介质Sepharoce 4FF纯化疫苗，去除培养基 杂蛋白，处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用该方法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacry S-500 HR，如甲肝疫苗等。
抗生素聚合物分析
《中国药典》自2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的百分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤去测定。
当目标蛋白的物理特性如分子量、等电点等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同pH缓冲液的试管中，可简单地测出pI, 并确定纯化用缓冲液的最佳pH。
选择层析方法
在对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一、使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广泛的介质如Superose、Sephacryl HR根据分子量将样品分成不同组份。
二、用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。也可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一部即可得到高纯度样品。
三、大体积的样品、常使用离子交换层析加以浓缩及粗纯化。高盐洗脱的样品，可再用疏水层析纯化。疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，洗脱样品又可直接上离子交换等吸附性层析。两种方法常被交替使用于纯化流程中。
纯化大量粗品
处理大量原液时，为避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大颗粒离子交换介质。扩张柱床吸附技术利用多种STREAMLINE截止，直接从含破碎细胞或组织萃取物的发酵液中俘获蛋白。将离心、超滤、初纯化结合为一，提高回收率，缩短纯化周期。
纯化硫酸氨样品
硫酸氨沉淀方法常被用来初步净化样品，经处理过的样本处于高盐状态下，很适合直接上疏水层析。若作离子交换，先用HiTrap HIC Test Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八种疏水介质中选择最适合介质及最佳的纯化条件。低盐洗脱的样品可稍加稀释或直接上其他吸附性层析。
纯化糖类分子
固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麦等的凝集素，结合碳水化合物的糖类残基，很适合用作分离糖化细胞膜组分、细胞、甚至亚细胞细胞器，纯化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB亲和层析介质，可俘获整个细胞或大复合物，如膜囊等。
纯化膜蛋白
膜蛋白分离长使用去污剂使其保持活性。离子性去污剂应选用与目标蛋白电荷相反者，以避免在作离子交换时蛋白竞争交换介质，藉此除去去污剂。非离子性去污剂可用疏水层析法除去。
纯化单抗、抗原
单抗多为IgG，来源主要是腹水和混合瘤培养上清夜。腹水有大量白蛋白、转铁蛋白和宿主抗体等。Protein G和ProteinA对IgG的Fc区有专一性亲和作用，能一步醇化各种不同源的IgG。血清互补剂如小牛血清可先用蛋白G预处理，在培养前除去IgG。重组蛋白A介质rProtein A Sepharose FF对IgG有更高的栽量和专一性，基团脱落更少。脱落的rProtein A用离子交换Q Sepharose Hp或凝胶过滤Superdex 200，很容易去除。
疏水层析pheny1 Sepharose HP也很适合纯化IgG。宿主抗体和污染IgG可用凝胶过滤Superdex 200在精细纯化中去除。
纯化IgG抗原最有效的方法是用活化偶联介质如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶联IgG，再进一步获取IgG抗原。
HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来从蛋清里纯化IgY，结合量达100 mg纯IgY。
纯化重组蛋白
重组蛋白在设计、构建时应已融化入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或溶解产物，扩张柱床吸附技术STREAMLINE便很适合作粗分离。
纯化包涵体蛋白
包涵体蛋白往往需溶于6M盐酸胍或尿素中。高化学稳定性的Sepharose12及Sepharose 6FF凝胶过滤介质很适合在变性条件下做纯化。变性纯化后的蛋白质需要复性至蛋白的天然构象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分别被发现有助包涵体蛋白的复性。一般包涵体蛋白样品的纯度越高复性效果越好。SOURCE 30 RPC反相层析介质很适合纯化复性前的粗品，并可以使1M NaOH重生。此方法纯化后的包涵体蛋白，复性回收效率明显提高。
包涵体蛋白固相复性
将包涵体蛋白在变性条件下固定（吸附）在层析介质上，一般用Sepharose FF离子交换层析介质。去除变性剂后，蛋白在介质上成功复性，再将复性好的蛋白洗脱下来。固相复性避免了一般复性过程中蛋白聚体的形成，所以复性锝率更高，而且无需大量稀释样品，并将复性和初纯化合二为一，大大节省时间及提高回收率。
固相复性方法也被用于以HiTrap Chelating金属螯合层析直接复性及纯化包涵体形式表达的组胺酸融合蛋白；以及以HiTrap Heparin肝素亲和层析直接复性及纯化包涵体形式表达的含多个赖氨酸的融合蛋白。两种亲和层析预装柱均可反复多次重复使用。
纯化中草药有效成分
中药的化学成分极其复杂。传统中药多是前熬后服用，有效成分多为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合地利用多种层析方法，如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶同时具备吸附性层析和分子筛选功能，例如，用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内酯、萜类、甾类等。
生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，HiTrap SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常相似的生物碱。相反，黄酮、醌类、皂甙、有机酸等可溶预溶于偏碱的缓冲液中，在HiTrap Q阴离子交换柱上分离效果良好。
一般多糖纯化大多使用分子筛，如Sephadex，Sephacry1。若分子量在60万以下，并需更高等分辨率，可选择新一代的Superdex。一种植物可能含水溶性、酸溶性、碱溶性多种多糖。综合利用分子筛及离子交换层析有助进一步获各组分纯品。另外，多糖药物需去除可引起过敏反应的蛋白质，传统Sevag方法用丁醇脱蛋白需数十次。阴阳离子交换法可以一、两步快速去除多糖中残存的蛋白质。 SURCE 5、15、30RPC反相层析也很适合各种中药有效成分的检测、分离和放大制备。由于中药的成分非常复杂，SURCE反相层析可用范围为PH1-14，并可用1M NaOH、1M HCI清洗、再生。比传统硅胶反相层析更易于工艺优化及在位清洗，寿命也更长。
纯化肽类
肽类的来源有天然萃取、合成肽和重组肽三种。肽容易被酶降解，但可以从有机溶剂或促溶剂中复性，所以以高选择性的反相层析如Sephasil 、PepRPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或离子交换作纯化。Superdex Peptide HR是专为肽分子纯化设计的凝胶过滤预装柱，能配合反相层析作出更精美的肽图。肽分子制备可用离子交换配合凝胶过滤Superdex 30 PG。
纯化核酸、病毒
核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换如Mono Q、SOURCE Q分离核酸。
纯化寡核苷酸
寡核苷酸多应用在反义（anti-sense）DNA、RNA测序、PCR和cDNA合成等的研究。合成后含三苯甲基的寡聚核苷酸译音离子、以阴离子交换的Mono Q或快速低反压的SOURCE Q在PH12下可去除副产物，并避免凝集和保护基的脱落。载量大大高过反相层析，可用做大量制备。不含三苯甲基的失败序列可用反相柱ProRPC去除。
脱盐、小分子去处
使用凝胶过滤介质Sephadex G10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting(5ml)可用针筒操作。HiTrap Desalting(26ml)可在数分钟为多至10 ml样品脱盐。
疫苗纯化
使用凝胶过滤介质Sepharoce 4FF纯化疫苗，去除培养基 杂蛋白，处理量可大于床体积10%。柱高一般40-70cm，整个过程约半至一小时。目前使用该方法生产的疫苗品种有乙肝、狂犬、出血热、流感、肺结核、小儿麻痹疫苗等。分子量较小的疫苗可使用Sephacry S-500 HR，如甲肝疫苗等。
抗生素聚合物分析
《中国药典》自2000年版起要求抗生素头孢曲松钠需要找出聚合物占产品的百分比，规定使用Sephadex G10凝胶过滤去测定。
