【转帖】7cm/11cm/17cm IPG胶条等电聚焦
丁香园论坛
1032
（一）第一向等电聚焦（用自制溶液）
1. 从冰箱中取 -20 ℃冷冻保存的水化上样缓冲液（ I ）（不含 DTT ，不含 Bio-Lyte ）一小管（ 1ml/ 管），置室温溶解。
2. 在小管中加入 0.01g DTT ， Bio-Lyte 按照如下表格 1ml 的量加，充分混匀。
IPG
pH Range Bio-Lyte Ampholyte(Stock)
Range Conc.(w/v) Sample Solution Volume
Per 1ml per 5ml per 50ml
3-10 3-10 40% 5ul 25ul 250ul
4-7 4-6 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
5-7 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
3-6 3-5 20% 5ul 25ul 250ul
4-6 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
5-8 5-8 40% 5ul 25ul 250ul
7-10 7-9 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
8-10 20% 5ul 25ul 250ul
3. 从小管中取出 400 m l 水化上样缓冲液，加入 100 m l 样品，充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于 4:1 。具体的上样体积如下表，
ReadyStrip TM IPG胶条的长度 上样体积
7 cm 125ul-250ul
11cm 185ul-370ul
17cm 300ul-600ul
其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表，
IPG 胶条的长度 分析型的上样量 （银或 SYPRO Ruby 染色） 制备型的上样量 （考马斯亮蓝染色）
7 cm 10-100ug 蛋白 200-500ug 蛋白
11cm 50-200ug 蛋白 250-1,000ug 蛋白
17cm 100-300ug 蛋白 1-3mg 蛋白
4. 从冰箱取 -20 ℃冷冻保存的 IPG 预制胶条，于室温放置 10 分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各 1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制 IPG 胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有 + ）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶 液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
IPG 胶条的长度 矿物油体积
7 cm 1 ml
11cm 2 ml
17cm 3 ml
9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序 （以下程序为推荐程序，不同样品需要根据实际情况进行实验条件优化） 。
7cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 4000V 线性 3 小时 升压
S4 4000V 快速 24,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 30-50 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
11cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 8000V 线性 4 小时 升压
S4 8000V 快速 40,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 50 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
17cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 2 小时 除盐
S3 10000V 线性 5 小时 升压
S4 10000V 快速 60,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 50-70 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
10. 聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳，否则将胶条置于样品水化盘中， -20 ℃冰箱保存 1 到 2 天。
1. 从冰箱中取 -20 ℃冷冻保存的水化上样缓冲液（ I ）（不含 DTT ，不含 Bio-Lyte ）一小管（ 1ml/ 管），置室温溶解。
2. 在小管中加入 0.01g DTT ， Bio-Lyte 按照如下表格 1ml 的量加，充分混匀。
IPG
pH Range Bio-Lyte Ampholyte(Stock)
Range Conc.(w/v) Sample Solution Volume
Per 1ml per 5ml per 50ml
3-10 3-10 40% 5ul 25ul 250ul
4-7 4-6 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
5-7 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
3-6 3-5 20% 5ul 25ul 250ul
4-6 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
5-8 5-8 40% 5ul 25ul 250ul
7-10 7-9 40% 2.5ul 12.5ul 125ul
8-10 20% 5ul 25ul 250ul
3. 从小管中取出 400 m l 水化上样缓冲液，加入 100 m l 样品，充分混匀。其中水化缓冲液与样品的比例不得小于 4:1 。具体的上样体积如下表，
ReadyStrip TM IPG胶条的长度 上样体积
7 cm 125ul-250ul
11cm 185ul-370ul
17cm 300ul-600ul
其中蛋白质的上样量与染色相关。具体的蛋白质上样量如下表，
IPG 胶条的长度 分析型的上样量 （银或 SYPRO Ruby 染色） 制备型的上样量 （考马斯亮蓝染色）
7 cm 10-100ug 蛋白 200-500ug 蛋白
11cm 50-200ug 蛋白 250-1,000ug 蛋白
17cm 100-300ug 蛋白 1-3mg 蛋白
4. 从冰箱取 -20 ℃冷冻保存的 IPG 预制胶条，于室温放置 10 分钟。
5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各 1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制 IPG 胶条上的保护层。
7. 分清胶条的正负极，轻轻地将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有 + ）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶 液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8. 在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
IPG 胶条的长度 矿物油体积
7 cm 1 ml
11cm 2 ml
17cm 3 ml
9. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序 （以下程序为推荐程序，不同样品需要根据实际情况进行实验条件优化） 。
7cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 4000V 线性 3 小时 升压
S4 4000V 快速 24,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 30-50 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
11cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 60 分钟 除盐
S3 8000V 线性 4 小时 升压
S4 8000V 快速 40,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 50 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
17cm 胶条
水化 12 小时（ 17 ℃） 被动水化
S1 250V 慢速 30 分钟 除盐
S2 1000V 快速 2 小时 除盐
S3 10000V 线性 5 小时 升压
S4 10000V 快速 60,000 伏小时 聚焦
S5 500V 快速 任意时间 保持
1） 选择所放置的胶条数。
2） 设置每根胶条的极限电流。（ 50-70 m A/ 根）
3） 设置等电聚焦时的温度。（ 17 ℃）
10. 聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳，否则将胶条置于样品水化盘中， -20 ℃冰箱保存 1 到 2 天。
