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免疫检测法 抗体制备技术
抗体（antibody，Ab）是机体免疫系统受到抗原刺激后产生的特异性球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。根据其重链稳定区的分子结构和抗原性的不同，可将为类Ig分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等五大类。由遗传基因决定所产生的抗体，称天然抗体（natural antibody），由抗原激发免疫细胞产生的抗体，称免疫抗体（immune antibody）或称特异地性抗体。人工制备的特异性抗体又可分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。
检测病原体常用的抗体有人工制备的特异性多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。
一、多克隆抗体制备技术
由于病原体或病原体相关抗原分子具有多种抗原决定簇，一种决定簇可激活机体具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，病原体或病原体相关抗原分子刺激机体产生的相应抗体，是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称多克隆抗体（polyclonal antibodies）。
（一）感染或免疫动物
（1）动物的选择：可作病原体或病原体相关抗原感染或免疫的选择对象有家兔、山羊或绵羊、马和豚鼠等实验动物。动物种类的选择主要是根据抗原的特性主所要获得抗体的量和用途。如马匹常用于制备大量抗毒素血清；豚鼠适用于制备抗酶类抗体和补体结合试验用的抗体，但抗血清产量较少。对蛋白质抗原，大部分动物均适合，常用的是家兔和山羊；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性，每批免疫宜同时使用数只动物。
（2）抗原种类（或类型）的选择：根据所制备抗血清的用途选用不同类型的抗原，如制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀，最好选用降解的蛋白质抗原，而用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀，最好选用自然的蛋白质抗原。若制备抗独特型抗体，所用抗原可以是可溶性Ig分子，或者是完整的细胞，也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。目前，以各类病原生物活体感染动物而获得多克隆抗体（抗血清）作为检测抗体，仍是常用方法。
（3）抗原剂量的选择：病原生物抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等的不同而异。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。一般而言，小鼠首次抗原剂量为50~400ug/次；大鼠为100ug~1mg/次；兔为200~1mg/次，加强免疫剂最为首次剂量的1/5~2/5。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法，病原生物活体感染动物的剂量（或数量）视病原体的种类而定。
（4）佐剂的应用：可溶性抗原加用佐剂增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，以刺激机体产生较强的免疫应答。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔或山羊，在加用佐剂时一次注入量一般为0.5~1mg/kg。不加佐剂，则抗原剂量应加大10~20倍。佐剂有福氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂等。其中最常用的是完全福氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）两种。IFA由羊毛脂1份、石腊油5份组成，每毫升IFA中加入1~20mg卡介苗即为CFA。
（5）感染或免疫的途径：抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2~4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA认作2~5次加强免疫，每次间隔2~3周，皮下或腹腔注射加强免疫。感染途径视感染病原体的种类和被感染动物而定。
（6）多克隆抗体（抗血清）的提取：完成免疫程序后，先取少量血清测试抗体效价达到要求时，即可从动物心脏穿刺（豚鼠及家兔），颈静脉或颈动脉放血（家兔或羊），待血液凝固后，离心深沉分离出血清，加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。
（二）抗血清的鉴定
抗血清的效价可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单向免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶免疫反应及放射免疫等方法进行测定。检查抗血清的纯度可采用免疫电泳、琼脂双向扩散及交反应试验等方法检测。
抗体的特异性是指对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗体识别能力就强，通常以交反应率来表示。交反应率可用竞争抑制试验测定。
（三）抗血清的保存
抗血清经过56℃，30min加热灭活后，加入适当的防腐剂。一般常用最终浓度为1/10 000的硫柳汞、1/1 000的叠氮钠（NaN3）或加入等量的中性甘油。分装小瓶，置-20℃以下低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。亦可将抗血清冷冻干燥后保存。
抗体（antibody，Ab）是机体免疫系统受到抗原刺激后产生的特异性球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。根据其重链稳定区的分子结构和抗原性的不同，可将为类Ig分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等五大类。由遗传基因决定所产生的抗体，称天然抗体（natural antibody），由抗原激发免疫细胞产生的抗体，称免疫抗体（immune antibody）或称特异地性抗体。人工制备的特异性抗体又可分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。
检测病原体常用的抗体有人工制备的特异性多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三种类型。
一、多克隆抗体制备技术
由于病原体或病原体相关抗原分子具有多种抗原决定簇，一种决定簇可激活机体具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，病原体或病原体相关抗原分子刺激机体产生的相应抗体，是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称多克隆抗体（polyclonal antibodies）。
（一）感染或免疫动物
（1）动物的选择：可作病原体或病原体相关抗原感染或免疫的选择对象有家兔、山羊或绵羊、马和豚鼠等实验动物。动物种类的选择主要是根据抗原的特性主所要获得抗体的量和用途。如马匹常用于制备大量抗毒素血清；豚鼠适用于制备抗酶类抗体和补体结合试验用的抗体，但抗血清产量较少。对蛋白质抗原，大部分动物均适合，常用的是家兔和山羊；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性，每批免疫宜同时使用数只动物。
（2）抗原种类（或类型）的选择：根据所制备抗血清的用途选用不同类型的抗原，如制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀，最好选用降解的蛋白质抗原，而用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀，最好选用自然的蛋白质抗原。若制备抗独特型抗体，所用抗原可以是可溶性Ig分子，或者是完整的细胞，也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。目前，以各类病原生物活体感染动物而获得多克隆抗体（抗血清）作为检测抗体，仍是常用方法。
（3）抗原剂量的选择：病原生物抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等的不同而异。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。一般而言，小鼠首次抗原剂量为50~400ug/次；大鼠为100ug~1mg/次；兔为200~1mg/次，加强免疫剂最为首次剂量的1/5~2/5。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法，病原生物活体感染动物的剂量（或数量）视病原体的种类而定。
（4）佐剂的应用：可溶性抗原加用佐剂增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，以刺激机体产生较强的免疫应答。如用可溶性蛋白质抗原免疫家兔或山羊，在加用佐剂时一次注入量一般为0.5~1mg/kg。不加佐剂，则抗原剂量应加大10~20倍。佐剂有福氏（Freund’s）佐剂、脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂等。其中最常用的是完全福氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）和不完全福氏佐剂（incomplete Freund’s adjuvant，IFA）两种。IFA由羊毛脂1份、石腊油5份组成，每毫升IFA中加入1~20mg卡介苗即为CFA。
（5）感染或免疫的途径：抗原注射途径可根据不同抗原及试验要求，选用皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内等不同途径注入抗原进行免疫。一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2~4周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA认作2~5次加强免疫，每次间隔2~3周，皮下或腹腔注射加强免疫。感染途径视感染病原体的种类和被感染动物而定。
（6）多克隆抗体（抗血清）的提取：完成免疫程序后，先取少量血清测试抗体效价达到要求时，即可从动物心脏穿刺（豚鼠及家兔），颈静脉或颈动脉放血（家兔或羊），待血液凝固后，离心深沉分离出血清，加入0.1%叠氮钠作为防腐剂。
（二）抗血清的鉴定
抗血清的效价可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单向免疫扩散、溶血试验、凝集反应、酶免疫反应及放射免疫等方法进行测定。检查抗血清的纯度可采用免疫电泳、琼脂双向扩散及交反应试验等方法检测。
抗体的特异性是指对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗体识别能力就强，通常以交反应率来表示。交反应率可用竞争抑制试验测定。
（三）抗血清的保存
抗血清经过56℃，30min加热灭活后，加入适当的防腐剂。一般常用最终浓度为1/10 000的硫柳汞、1/1 000的叠氮钠（NaN3）或加入等量的中性甘油。分装小瓶，置-20℃以下低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。亦可将抗血清冷冻干燥后保存。
