单克隆抗体制备-小鼠腹水实验

一、材料

小鼠： 2 或 4 只 B A L B /c雌性老年鼠

PristaneCSigma T-7640)

Tuberculin 注射器 (I cc)

无菌针头（2 1 号）
杂交瘤细胞，每只小鼠5X 10⁶ 个细胞

台酚蓝染液，0.4% (Sigma T 8154)

无菌尖底离心管（15m l 或 50 ml)

无 菌 Dulbecco's 磷酸盐缓冲液（D-PBS)

二、设备

细胞计数器

光学相差显微镜

台式离心机

三、时间要求

4 只小鼠的Pristane 预刺激时间约需10min, 应在注射杂交瘤细胞前 10 〜14d 完成，但是不要超过3 周 。应提前培养杂交瘤细胞：准备注射用细胞大约需要 30 min，注射细胞大 概 需 要 10min。

四、 步骤

1.计划注射细胞前10〜14d 用 Pristane 预刺激小鼠。用手固定住小鼠，头部向下
倾斜使肠管退避，并在下腹部中线右侧定位注射点（图 6.1)。 21 号注射器，倾 斜 ，与注射点呈角度（45度)刺人皮下层后腹腔注射Pristane 0.5 ml。由于试剂的黏性可能需一定的压力推送，注意针头不要穿刺过深。注射后，简单地握住针头使针筒内无压力并轻轻退出针头 。这样可避免Pristane从注射部位渗漏。

2.注 射 前 1〜2d 用新鲜的培养基传代杂交瘤细胞以保证其处于对数生长期。用台
酚蓝染色确定注射当天杂交瘤细胞的活细胞比例达90 % 〜100 % 。

3.充分混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液(取少量细胞悬液，如 30〜50jul)10倍稀释于台酚蓝+ D-PBS 混合液（I : 1 混合）并放置 5〜10min。将一滴稀释液移至血球计数板上 ，用光学相差显微镜计数存活的细胞并计算每毫升细胞悬液中活细胞数。

4.将含有所期望活细胞数量的细胞悬液加人15ml 或 50m l 的尖底离心管中，室温下 200 g 离 心 5 mm。弃上清后用室温下的 I>PBS 再次悬浮细胞，使其含量为 10 X10⁶ 个/ml。为保持细胞活性，应尽快将这些细胞注人小鼠体内。

5.用 带 有 21 号针头的无菌注射器吸取混勻的细胞悬液并向小鼠腹腔（L p.) 注射0. 5 ml，注射的位置和方法同 Pristane 预刺激部分 [见步骤（1)] 。

6.观察注射杂交瘤细胞后的小鼠 M h，且至少要在其后隔天观察其一般健康状况和腹水产生情况

五、腹 水 采 集

1.材料

无菌乙醇纱布垫

无菌针头（1 8 号）

无菌尖底离心管（15 ml)

无菌尖底离心管 (50 ml)

无菌巴斯德移液管

2.时间需求

通常在注射杂交瘤细胞后的 7〜10d 小鼠腹水即可形成。收集和离心每次收获 (穿刺引流）的腹水大约需要 30 min。 7d 内每只小鼠最多行三次穿刺以收获腹水，并于最后一次收集后实施安死术。

3. 步骤

（1）观察到小鼠中度腹胀时第一 次收获腹水 D 同样可以通过称量小鼠体重的方法计算出腹水的累积量。动物福利专家推荐，收获腹水前增加的体重不要超过基础体重水平的 20 % 。如果太早开始收获通常产量会减少，但如果不经抽取等到产生了过多腹水才允许收集, 则小鼠的窘迫和病死率将会上升。

（2）将预先准备好的无菌 15ml 尖底离心管平稳地放在合适的管架上。用手固定小鼠，尽可能多的抓住颈背部皮毛以便拉伸腹部皮肤。用无菌乙醇纱布垫消毒腹部。

（3）实施穿刺抽液术，用 1 8 号针头，倾斜，呈 45度角刺人下腹部腹中线的右侧，规避上腹部的脏器和腹中线附近的血管。针头要直接对准打开的离心管，因为液体可能在高压下喷出。或许，腹水也可能不易流出，此时需要轻柔挪动针头（包括旋转，改变针头刺入的深度和角度）以开始或继续引流。

（4） 通过针头收集尽可能多的腹水并小心将其转移。通常每只小鼠一次可收获 4〜6 ml 腹 水 ，但 可 在 2〜IOml 变动。如果腹水顺着针头流出或针头去除后腹水依然显著外 流 ，要将外流的腹水从针头注射点处滴入离心管中。轻轻按摩注射点周围腹部有助于腹水流出。应 格 外 注 意 的是 ，在 这 些 情 况 下 收 集 腹 水 过 程 要 无 菌 并 且 要 避 免 动 物窘 迫 。

（5）每次收获腹水时对注射相同杂交瘤细胞系的一组小鼠进行穿刺，收集的腹水可合并在一起。 1500 g 离 心 腹 水 10min 以沉淀并移除腹水中的细胞。如果腹水出现凝块，离心前用无菌巴斯德移液管在凝块和离心管侧壁间划动，使凝块与管壁分开。将腹水上清液转移至无菌 50 ml 离心管中并且于收获期间冻存在-20℃。

（6）将小鼠放回鼠笼并每日观察提示窘迫迹象的健康变化。如果健康状况衰落不明显 ，可再次实施穿刺抽液。再次穿刺抽液腹水需积累大约 48 h; 在第二次抽液 24〜48 h 后对小鼠实施安死术并进行第三次穿刺抽液。所有收获的腹水离心后可合并到同一离心管中。

（7）解冻腹水，用高速离心机离心使其澄清，纯化前去除脂质。经这种粗制的腹水可以作为抗体使用或用于进一步地纯化。为了长期保存，滴定抗体效价，并将腹水按每次使用量分装成小包装冻存于-70℃, 避免使用期间的反复冻融。

六、结果

从每只小鼠中收集的腹水体积为 5〜10 ml。腹水中单克隆抗体的含量为 1〜10mg/ml, 即两 只 B A L B /c 小鼠可产 10〜20ml 腹 水 ，含 有 10〜200mg 抗体。不同杂交瘤细胞系之间和相同杂交瘤细胞系的各批次间的腹水产量可能不同。