小鼠腹水抗体的制备
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1．抗原的处理与小鼠腹水粗抗体的收集 现在以B亚基的抗体制备为例说明： 取2mg的蛋白，溶于100µl的10％SDS中，加入等体积的上样缓冲液，沸水浴3min，进行SDS－PAGE。 将胶的两边缘切带染色，脱色后在相应的位置从分离胶上切下未染色目的蛋白带，无菌水洗涤，用匀浆器匀浆后，再在2～5mM的PBS中透析5h以上，冷干。 将冷干的样品用500～800µl 的2mM～5mM的PBS溶解（得到体积约600～1000µl）,加入等体积的弗氏完全佐剂，大约乳化2h～3h。确保乳化完的蛋白浓度为0.5~1.0mg/ml。将乳化好的混合液用1ml的一次性注射器注射小鼠，每只50～100µl，即50～100µg的抗原蛋白。 第一次加强注射：10～14天后将制备的样品用弗氏不完全佐剂乳化，同样注射小鼠。 第一次加强注射后10天左右，用小鼠的血清，通过酶联免疫的方法（ELISA）测定腹水抗体效价来检测抗体的存在。 第二次加强注射：如果ELISA得到阳性的结果，用弗氏不完全佐剂乳化抗原，再次注射小鼠，并在注射后的2～3天后注射H22腹水瘤细胞，每次注射量再1.5×106~2.0×106个细胞，7天后产生腹水。如果两周后小鼠仍无腹水，再次注射抗原以及瘤细胞。 收集腹水，每只小鼠可以收集几次，每次3～10ml不等，收集腹水至小鼠死亡。腹水中加入0.01%的叠氮化钠以防止长菌，再在12000rpm离心2次，保留上清。测定效价后，进行抗体的纯化，分装，－70°C保存。 [注]： （1）在SDS-PAGE时，分离胶中加入300µl SDS，浓缩胶中加入200µl SDS，以确保SDS足量。 （2）在制备蛋白样品过程中会损失一部分抗原大约25％～50％ （3）收集的小鼠腹水要分装到小指管中，不同的小鼠产生的腹水效价不同，做好标记。
2．抗体纯化 用1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)调节粗制抗体的pH值。 用0.1mol/L Tris(pH8.0)平衡柱子。 将抗体溶液用蛋白G微珠层析柱过滤，每次上2ml的样品。 用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。 用10倍体积的0.01mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。 用2ml的50mmol/L 甘氨酸(pH3.0)洗脱滤柱。收集洗脱峰于装有1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)的试管内，轻轻摇匀。 用10倍体积的0.1mol/L Tris(pH8.0)洗涤微珠。重复以上过程。 测定蛋白浓度，并进行SDS-PAGE检测抗体的纯度。 [注]：配Tris与甘氨酸溶液用盐酸来调pH值
3．酶联免疫检测抗体的效价（ELISA） 用包被液稀释抗原至50～100µg/ml，加入酶标板中，每孔100µl ，4°C过夜 用洗涤液清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5min～8min，37°C下用封闭液封闭酶标板4h以上。 待测的腹水抗体按1：1000～1：128000稀释，分别加入孔中，每孔100µl，37°C孵育2h ，再用洗涤液清洗3次。 将辣根过氧化物酶标记的二抗按照1：1000稀释，每孔加入每孔100µl，37°C孵育1h ，再洗涤3次。 加入辣根过氧化物酶显色液100µl，显色5min后，加入终止液100µl，终止显色。 以不注射抗原的小鼠腹水为阴性对照（也要相应于含抗体的腹水稀释），以只加显色液与终止液的孔为空白对照，用酶标仪测定492nm波长下的吸收值，确定抗体的效价。 所用试剂： 包被液：0 .50g Na2CO3，0.4g NaHCO3 ，200ml，pH9.6 PBS ：10mmol/LNaH2PO4, 10mmol/LNa2HPO4,150mmol/LNaCl，pH7.4 封闭液：3％BSA溶于PBS中 洗涤液：0.05~0.1％Tween-20溶于PBS中 底物缓冲液：0.1mol/L柠檬酸，0.2mol/LNa2HPO4，pH5.0，用时每10ml的缓冲液加入4mgOPD(邻苯二胺)以及20µl 30％H2O2 终止液：2mol/L H2SO4 [注]： （1）在洗涤时应当确保充分，否则会出现阴性对照的值偏大。 （2）空白对照最好做一排孔（8个或12个）。
（3）底物缓冲液要现用现配。 |
