HLA-I重链、轻链的制备（包涵体的制备）
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HLA-I 重链、轻链的制备（包涵体的制备）
此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链，其中重链为HLA-A2分子的α链（胞外段，包括α1至α3功能区），轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP（生物素结合部位），该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后，经过原核表达而获得。
【试剂及配制】
（1）LB培养基
（2）0.4M IPTG
（3）50mg/ml 溶菌酶
（4）1.0M MgCl2
（5）2mg/ml DNA酶I，溶于50%甘油，75mM NaCl
（6）Triton-X 100
（7）1M DTT
（8）重悬液（PH8.0）50mM Tris-HCl(PH8.0)25%(W/V) 蔗糖 1mM EDTA 0.1%(W/V) 叠氮钠 10mM DTT(新鲜加入)
（9）洗涤液I(PH 8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)0.5% Triton-X 100 100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠
1mM DTT(新鲜加入)
（10）洗涤液II(PH8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠 1mM DTT(新鲜加入)
（11）尿素溶液（PH6.0）25mM MES(PH6.0) (维持电解质溶液)8M 尿素 10mM EDTA 0.1mM DTT(新鲜加入)
（12）HLA-A2重链、β2微球蛋白表达质粒，以及宿主菌。
【操作步骤】
（1） 挑取含有目的基因（HLA-A2重链、β2微球蛋白基因）表达质粒的宿主菌单克隆接种入100ml LB培养液。37o C水平振摇过夜。
（2） 每升含有抗生素的LB培养液中加入12ml饱和菌液,共6升。
（3） 37o C水平振摇至OD600 =0.6，取1ml菌液（未诱导），离心取菌体沉淀置-20℃冻存。余下的6L菌液中加入0.4M IPTG 6ml，至终浓度为0.4mM,进行诱导。
（4） 37o C水平振摇4小时，取0.5ml诱导后的菌液，离心取沉淀，置-20℃冻存。
（5） 诱导后的约6L菌液于4℃离心，4000rpm X 15分钟
（6） 沉淀重悬于60ml重悬液，分装在两个50ml离心管中，置-80℃冻存。
（7） 解冻菌液，倒入100ml烧杯，用磁力搅拌器中速搅拌。
（8） 边搅拌边滴入：1.2ml 50mg/ml 溶菌酶（终浓度=1mg/ml）
300ul 1.0M MgCl2 (终浓度=5mM)
1.0ml 2mg/ml DNA酶I(溶于50%甘油，75mM NaCl)
600ul Triton-X 100（终浓度=1%）
600ul 1M DTT（终浓度=10mM）
（9） 将盛有细菌裂解物的100ml烧杯置于冰浴中。
（10） 超声裂菌：将探头插入菌液，使其深度最大，但不要接触烧杯的底部。
（11） 将超声裂菌器裂菌1.5分钟，每次间隔0.5秒。
（12） 转移菌液至3个25 X 89mm Beckman 离心管中，在Beckman Cs-15R离心机中用FO 630 转头，以最大速度于4℃离心10分钟。
（13） 取50ul上清，标记为S1 ,置-20℃冻存。
（14） 弃上清，加1-2ml洗涤液I。
（15） 用搅拌棒将沉淀打散，加洗涤液I至15ml，继续搅拌直到沉淀完全分散。
（16） 置冰浴，用超声裂菌器裂菌1.5分钟，每次间隔0.5秒。
（17） 重复步骤（12）至（16）。
（18） 取50ul上清，记为S2 ，余弃去。
（19） 重复洗涤3次，取上清,记为S3 - S5
（20） 同上法，用洗涤液II悬浮沉淀。
（21） 同上法离心，4℃，10分钟。
（22） 弃上清，沉淀重悬于200-1000μl 双蒸水，一旦白色浆状物形成，立即重悬沉淀于10-30ml尿素溶液中。
（23） 4℃，10分钟，离心包涵体。
（24） 转移上清至15ml离心管。
（25） 取2μl包涵体，加98ul尿素溶液稀释，测240nm-320nm的OD值。
（26） 计算蛋白浓度，取500-10000nmol蛋白，置离心管中。
（27） 在液氮中速冻，并保存于-80℃
（28） 将各时期的样品行SDS-PAGE(10-12%)。共8个样品：诱导前，诱导后，S1 - S5 最终包涵体样品。
