HLA-I重链、轻链的制备(包涵体的制备)
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HLA-I 重链、轻链的制备(包涵体的制备)
此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链,其中重链为HLA-A2分子的α链(胞外段,包括α1至α3功能区),轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP(生物素结合部位),该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后,经过原核表达而获得。
【试剂及配制】
(1)LB培养基
(2)0.4M IPTG
(3)50mg/ml 溶菌酶
(4)1.0M MgCl2
(5)2mg/ml DNA酶I,溶于50%甘油,75mM NaCl
(6)Triton-X 100
(7)1M DTT
(8)重悬液(PH8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)25%(W/V) 蔗糖 1mM EDTA 0.1%(W/V) 叠氮钠 10mM DTT(新鲜加入)
(9)洗涤液I(PH 8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)0.5% Triton-X 100 100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠
1mM DTT(新鲜加入)
(10)洗涤液II(PH8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠 1mM DTT(新鲜加入)
(11)尿素溶液(PH6.0)25mM MES(PH6.0) (维持电解质溶液)8M 尿素 10mM EDTA 0.1mM DTT(新鲜加入)
(12)HLA-A2重链、β2微球蛋白表达质粒,以及宿主菌。
【操作步骤】
(1) 挑取含有目的基因(HLA-A2重链、β2微球蛋白基因)表达质粒的宿主菌单克隆接种入100ml LB培养液。37o C水平振摇过夜。
(2) 每升含有抗生素的LB培养液中加入12ml饱和菌液,共6升。
(3) 37o C水平振摇至OD600 =0.6,取1ml菌液(未诱导),离心取菌体沉淀置-20℃冻存。余下的6L菌液中加入0.4M IPTG 6ml,至终浓度为0.4mM,进行诱导。
(4) 37o C水平振摇4小时,取0.5ml诱导后的菌液,离心取沉淀,置-20℃冻存。
(5) 诱导后的约6L菌液于4℃离心,4000rpm X 15分钟
(6) 沉淀重悬于60ml重悬液,分装在两个50ml离心管中,置-80℃冻存。
(7) 解冻菌液,倒入100ml烧杯,用磁力搅拌器中速搅拌。
(8) 边搅拌边滴入:1.2ml 50mg/ml 溶菌酶(终浓度=1mg/ml)
300ul 1.0M MgCl2 (终浓度=5mM)
1.0ml 2mg/ml DNA酶I(溶于50%甘油,75mM NaCl)
600ul Triton-X 100(终浓度=1%)
600ul 1M DTT(终浓度=10mM)
(9) 将盛有细菌裂解物的100ml烧杯置于冰浴中。
(10) 超声裂菌:将探头插入菌液,使其深度最大,但不要接触烧杯的底部。
(11) 将超声裂菌器裂菌1.5分钟,每次间隔0.5秒。
(12) 转移菌液至3个25 X 89mm Beckman 离心管中,在Beckman Cs-15R离心机中用FO 630 转头,以最大速度于4℃离心10分钟。
(13) 取50ul上清,标记为S1 ,置-20℃冻存。
(14) 弃上清,加1-2ml洗涤液I。
(15) 用搅拌棒将沉淀打散,加洗涤液I至15ml,继续搅拌直到沉淀完全分散。
(16) 置冰浴,用超声裂菌器裂菌1.5分钟,每次间隔0.5秒。
(17) 重复步骤(12)至(16)。
(18) 取50ul上清,记为S2 ,余弃去。
(19) 重复洗涤3次,取上清,记为S3 - S5
(20) 同上法,用洗涤液II悬浮沉淀。
(21) 同上法离心,4℃,10分钟。
(22) 弃上清,沉淀重悬于200-1000μl 双蒸水,一旦白色浆状物形成,立即重悬沉淀于10-30ml尿素溶液中。
(23) 4℃,10分钟,离心包涵体。
(24) 转移上清至15ml离心管。
(25) 取2μl包涵体,加98ul尿素溶液稀释,测240nm-320nm的OD值。
(26) 计算蛋白浓度,取500-10000nmol蛋白,置离心管中。
(27) 在液氮中速冻,并保存于-80℃
(28) 将各时期的样品行SDS-PAGE(10-12%)。共8个样品:诱导前,诱导后,S1 - S5 最终包涵体样品。