材料与仪器
过表达σ32 的大肠杆菌细胞株
氯霉素 氨苄青霉素 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 利福平 LB 培养基 SDS 样品缓冲液 脱氧胆酸钠
Oak Ridge 离心管 带刻度的聚丙烯锥形离心管 Tissue-TearorTM 匀浆器 超声破碎器
氯霉素 氨苄青霉素 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 利福平 LB 培养基 SDS 样品缓冲液 脱氧胆酸钠
Oak Ridge 离心管 带刻度的聚丙烯锥形离心管 Tissue-TearorTM 匀浆器 超声破碎器
步骤
材料与设备
过表达σ32 的大肠杆菌细胞株〔BL21(DE3)/pLysS,pLHN16〕
氯霉素
氨苄青霉素
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)
利福平
Oak Ridge 离心管（40-ml)
带刻度的聚丙烯锥形离心管（50-ml)
Tissue-TearorTM 匀浆器（Fisher Scientific15-338-55)
超声破碎器
试剂
LB 培养基
SDS 样品缓冲液（2X)
脱氧胆酸钠（DOC)(20% 储液)
(配方，见"试剂的配制"，PP.184~189)
操作程序
原材料的制备
本单元所用的大肠杆菌细胞株〔σ32 的过表达质粒为 pLHN16, 宿主菌为 BL21(DE3)/pLysS〕是按 Nguyen 等（1993) 所述方法构建的〔参见 Nuvagen 公同出版的 pETTM System Manual(Novagen,Inc.1995) 中关于 pETll 表达系统的应用〕。
1) 大肠杆菌于 37°C 摇瓶培养，摇瓶体积为 2000-ml，每瓶装 500 ml LB 培养基，在氯霉素（25ug/ml)/氰苄青霉素（100ug/ml) 的选择压力下，培养至 A550nm 达 0.9。
2) 加 IPTG, 至终浓度为 1 mmol/L, 诱导 T7RNA 聚合酶表达。诱导 0.5 h 后，加利福平至终浓度为 150ug/ml, 以获得最大程度的过表达。
3) 加利福平后 3.5 小时结束培养，4°C、8000r/min 离心 30 min, 收集细胞。将毎升培养液所得的细胞沉淀物重悬于 30 ml LB 培养基，再用 40-ml Oak Ridge 离心管，4°C、13000r/min 离心 10 min。细胞用干冰速冻，储存于-70°C 备用。
注：本单元所用的细胞虽是冻存的，但对于未知的蛋白质，用新鮮细胞制备要安全得多，特别是需要重折叠的话。细胞冻存最好不超过 5d(天）。
为监测纯化操作步骤的取样
为监测纯化的进程和效果，有必要在每个纯化阶段对每个组分进行下列操作步骤。
1) 测量体积。
注：一个非常便捷的办法是，对所用的各种大小的试管例如：Eppentbrf 管、Oak Ridge 离心管等，细心地加 H2O 并标出各体积所对应的水平线，准备好一套经过标定的管子，以用来快速测量溶液的体积。带刻度的锥形离心管也可方便地用于这一目的。
2) 将一份 36-ul 的样品加入 84ul SDS 样品缓冲液 (2X) 中，70~90°C 水浴加热 2~5 min, 保存于 4°C 。
3) 留取部分样品（150ul) 供蛋白测定和免疫定量（inrnumo-quantitation) 用。将上述信息记录在纯化记录表中，并以此编制纯化总结表。必须小心地留存好有代表性的样品。这就是说，应在临取样前将整个组分真正混合均匀。这一点对那些含有沉淀或重悬的不溶物质的组分来说尤为重要。为方便起见，在留取用于 SDS 凝胶电泳分析和蛋白质定量测定的样品时，可造一张表，列出样品A~J 及其有关描述和体积，以及要检査的两种层析柱。在本单元中，还将指导你在不同的纯化阶段进行取样（如各实验中所述)，这些样品将用于纯化方案的补充实验，如本单元最后一节所述。
超声破碎细胞
1) 取 3 g 大肠杆菌细胞 [BL21(DE3)/PLysS，pLHN16〕于室温下解冻。细胞经组织破碎器短暂匀浆后，重悬于 20 ml 缓冲液 A(置一 40-ml 的 Oak Ridge 离心管) 中。
注：纯化σ32 时，缓冲液 A 中不加还原剂，因σ32 不含半胱氨酸残基。通常，所有缓冲液中都要加 (0.1~0.5 mmol/L 二硫苏糖醇，以防蛋白质氧化。
2) 用大超声头，设定 8 个循环和 50% 的时间间隔，在冰浴中超声 90s。
注：BL21 DE3 细胞携带有表达 T7 溶菌繭的 pLysS。不过，该溶菌酶不能从内側攻击细胞壁，故此基因不是致死的。当细胞冻融时，溶菌醅会接近细胞壁，使细胞裂解。在有些情况下，这足以使细胞破裂，但必须解决好因 DNA 释出而产生的粘度问题。一种方法是用相当大量的 DNA 酶 I 消化，但这可能是昂贵的，并对混合物又加入了一种蛋白质，因而可能引起更多的麻烦（例如，正在纯化 DNA 结合蛋白的话)。为此，为确保细胞完全玻碎，我们采用了超声处理法。这可在很大程度上切断 DNA, 使包涵体的沉淀变得较为容易。
3) 加 DOC, 使终浓度为 0.2%(即，加约 240ul 的 20%DOC 储液)。混匀，静置 10 min
注：1. 0.2%DOC 是用来帮助释出少量不溶性蛋白质的，在高浓度（2.0%) 下则释出细胞膜的成分（见实验 2)。DOC 溶解得相当慢，因此，其储液应提前 1 天配制。2. 若只想分离包涵体. 不希望对上清中的可溶性蛋白质作进一步的分级分离（如下文的样品 B), 则可在这一步加 DOC 至终浓度 2%, 并略去实验 2 中所述的第二次 DOC 洗涤。
4) 取第一个样品（样品 A), 如上所述见 p.146)。
包涵体和可溶性提取物的制备
1) 为沉淀包涵体，细胞裂解物用小转头（SorvallSS-34 或 Beckman JA20),4°C、13000r/min 离心 10 min。
2) 轻轻倾出上清（取样品 B)，冰上保存，供 PEI 沉淀和免疫亲和层析（IAC) 纯化核心 RNA 聚合酶-P2 复合物用（见实验 3)。关于包涵体中的过表达的溶解和复性，见实验 2。
过表达σ32 的大肠杆菌细胞株〔BL21(DE3)/pLysS,pLHN16〕
氯霉素
氨苄青霉素
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)
利福平
Oak Ridge 离心管（40-ml)
带刻度的聚丙烯锥形离心管（50-ml)
Tissue-TearorTM 匀浆器（Fisher Scientific15-338-55)
超声破碎器
试剂
LB 培养基
SDS 样品缓冲液（2X)
脱氧胆酸钠（DOC)(20% 储液)
(配方，见"试剂的配制"，PP.184~189)
操作程序
原材料的制备
本单元所用的大肠杆菌细胞株〔σ32 的过表达质粒为 pLHN16, 宿主菌为 BL21(DE3)/pLysS〕是按 Nguyen 等（1993) 所述方法构建的〔参见 Nuvagen 公同出版的 pETTM System Manual(Novagen,Inc.1995) 中关于 pETll 表达系统的应用〕。
1) 大肠杆菌于 37°C 摇瓶培养，摇瓶体积为 2000-ml，每瓶装 500 ml LB 培养基，在氯霉素（25ug/ml)/氰苄青霉素（100ug/ml) 的选择压力下，培养至 A550nm 达 0.9。
2) 加 IPTG, 至终浓度为 1 mmol/L, 诱导 T7RNA 聚合酶表达。诱导 0.5 h 后，加利福平至终浓度为 150ug/ml, 以获得最大程度的过表达。
3) 加利福平后 3.5 小时结束培养，4°C、8000r/min 离心 30 min, 收集细胞。将毎升培养液所得的细胞沉淀物重悬于 30 ml LB 培养基，再用 40-ml Oak Ridge 离心管，4°C、13000r/min 离心 10 min。细胞用干冰速冻，储存于-70°C 备用。
注：本单元所用的细胞虽是冻存的，但对于未知的蛋白质，用新鮮细胞制备要安全得多，特别是需要重折叠的话。细胞冻存最好不超过 5d(天）。
为监测纯化操作步骤的取样
为监测纯化的进程和效果，有必要在每个纯化阶段对每个组分进行下列操作步骤。
1) 测量体积。
注：一个非常便捷的办法是，对所用的各种大小的试管例如：Eppentbrf 管、Oak Ridge 离心管等，细心地加 H2O 并标出各体积所对应的水平线，准备好一套经过标定的管子，以用来快速测量溶液的体积。带刻度的锥形离心管也可方便地用于这一目的。
2) 将一份 36-ul 的样品加入 84ul SDS 样品缓冲液 (2X) 中，70~90°C 水浴加热 2~5 min, 保存于 4°C 。
3) 留取部分样品（150ul) 供蛋白测定和免疫定量（inrnumo-quantitation) 用。将上述信息记录在纯化记录表中，并以此编制纯化总结表。必须小心地留存好有代表性的样品。这就是说，应在临取样前将整个组分真正混合均匀。这一点对那些含有沉淀或重悬的不溶物质的组分来说尤为重要。为方便起见，在留取用于 SDS 凝胶电泳分析和蛋白质定量测定的样品时，可造一张表，列出样品A~J 及其有关描述和体积，以及要检査的两种层析柱。在本单元中，还将指导你在不同的纯化阶段进行取样（如各实验中所述)，这些样品将用于纯化方案的补充实验，如本单元最后一节所述。
超声破碎细胞
1) 取 3 g 大肠杆菌细胞 [BL21(DE3)/PLysS，pLHN16〕于室温下解冻。细胞经组织破碎器短暂匀浆后，重悬于 20 ml 缓冲液 A(置一 40-ml 的 Oak Ridge 离心管) 中。
注：纯化σ32 时，缓冲液 A 中不加还原剂，因σ32 不含半胱氨酸残基。通常，所有缓冲液中都要加 (0.1~0.5 mmol/L 二硫苏糖醇，以防蛋白质氧化。
2) 用大超声头，设定 8 个循环和 50% 的时间间隔，在冰浴中超声 90s。
注：BL21 DE3 细胞携带有表达 T7 溶菌繭的 pLysS。不过，该溶菌酶不能从内側攻击细胞壁，故此基因不是致死的。当细胞冻融时，溶菌醅会接近细胞壁，使细胞裂解。在有些情况下，这足以使细胞破裂，但必须解决好因 DNA 释出而产生的粘度问题。一种方法是用相当大量的 DNA 酶 I 消化，但这可能是昂贵的，并对混合物又加入了一种蛋白质，因而可能引起更多的麻烦（例如，正在纯化 DNA 结合蛋白的话)。为此，为确保细胞完全玻碎，我们采用了超声处理法。这可在很大程度上切断 DNA, 使包涵体的沉淀变得较为容易。
3) 加 DOC, 使终浓度为 0.2%(即，加约 240ul 的 20%DOC 储液)。混匀，静置 10 min
注：1. 0.2%DOC 是用来帮助释出少量不溶性蛋白质的，在高浓度（2.0%) 下则释出细胞膜的成分（见实验 2)。DOC 溶解得相当慢，因此，其储液应提前 1 天配制。2. 若只想分离包涵体. 不希望对上清中的可溶性蛋白质作进一步的分级分离（如下文的样品 B), 则可在这一步加 DOC 至终浓度 2%, 并略去实验 2 中所述的第二次 DOC 洗涤。
4) 取第一个样品（样品 A), 如上所述见 p.146)。
包涵体和可溶性提取物的制备
1) 为沉淀包涵体，细胞裂解物用小转头（SorvallSS-34 或 Beckman JA20),4°C、13000r/min 离心 10 min。
2) 轻轻倾出上清（取样品 B)，冰上保存，供 PEI 沉淀和免疫亲和层析（IAC) 纯化核心 RNA 聚合酶-P2 复合物用（见实验 3)。关于包涵体中的过表达的溶解和复性，见实验 2。
来源：丁香实验
