大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

1、感受态细胞的概念

重组 DNA 分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在 进化 过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系.

所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用.细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键.

制备出的 感受态细胞 暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌 甘油 或-70℃保存(有效期6个月).

2、转化的概念及原理

在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入 细菌 体内,使之获得新的遗传特性的一种方法.它是 微生物 遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.

受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.

大肠杆菌 的转化常用化学法( CaCl 2 法),该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子.

Ca2+处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保存,因此被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA.因操作简便,愈来愈为人们所接受.

3、感受态细胞制备及转化中的影响因素

⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过多次转接,及贮存在4℃的培养菌液. 细胞生长 密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株,OD600为0．5时,细胞密度在5×107个/ml左右.(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同).密度过高或不足均会使转化率下降.

此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的 突变 株,即不含限制性内切酶和 甲基化 酶的突变株.并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.

⑵、 质粒 DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降.一般地.

DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和.对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化.此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子.

⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃

⑷、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管, 移液枪头 等最好是新的,并经高压灭菌处理.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.

⑸、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低.