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单克隆抗体制备技术

Burnef（1957）细胞系群选择学说（clonal selection theory）认为，每一个淋巴细胞只具备单一的受体特异性，受到刺激后，只能产生一种针对其可识别的抗原决定簇的抗体；

抗体的多样性是由机体遗传存在着能与众多抗原决定簇起反应的淋巴细胞系而决定的；

一个祖先抗体形成细胞分裂繁殖而成的细胞系（克隆clone或无性繁殖细胞系）产生的抗体具有完全相同的分子结构和性状；

从一个克隆细胞系产生的抗体，称单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）；

一个动物被某一多价抗原免疫后所产生的抗体总特异性应是一群相关淋巴细胞中各单个细胞及其克隆产物特异性的总和。

同年（1975）Kǒhler和Milstein(1975)又用体细胞融合技术，将在体外难以传代培养的免疫动物淋巴细胞与同系动物肿瘤细胞融合，获得了可传代的“杂交瘤”细胞系（hybridoma cell Iine），创建了B淋巴细胞杂交瘤技术，或称抗体细胞工程技术，并于1984年获得Nobel医学奖。

这一技术的建立，开创了免疫学研究的新纪元，并将抗体在病症诊断、治疗和预防中的应用研究推向一个新的发展时代。近年来，抗体细胞工程技术已趋完善，并在小鼠-小鼠杂交瘤的基础上，又发展了小鼠-大鼠、小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。

制备McAb的小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术包括动物免疫、细胞培养、细胞融合、杂交瘤细胞系克隆和再克隆、抗体检测和扩增以及杂交瘤细胞株保存和复苏等技术步骤和操作流程。

（一）动物免疫

杂交瘤技术常用的瘤细胞来自于BALb/c小鼠，因此，一般选用6~10周龄，健康、发育良好的雌性BALb/c小鼠进行免疫。根据病原体的抗原性、免疫原性和小鼠免疫反应性决定免疫途径，免疫次数，间隔时间和持续时间。

病原微生物及其相关抗原多为颗粒性，免疫原性强，不加佐剂免疫小鼠，并可获得较好的免疫效果。如果为细菌，第一次腹腔或尾静脉注射1×107~5×107个/鼠，间隔2~3周重复注射1~2次，融合前3d用同样剂量腹腔或静脉注射加强免疫一次。

病原寄生虫多为可溶性抗原，免疫原性较弱，一般要加佐剂。可溶性抗原，可颗粒化或固相化，或使用细胞因子作为佐剂。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及蛋白质结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。

取1~100ug抗原与等量完全福氏佐剂（CFA）充分乳化后腹腔或皮下多点注射。以后每间隔2W以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂（CFA）腹腔或皮下注射，共3~5次。一般在融合前3d腹腔或静脉注射无佐剂原50~100ug加强免疫，此次注射要缓慢，以防止动物发生过敏性休克而死亡。

将小鼠麻醉后，打开腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢注入20~40ug可溶性抗原（可交联于载体上，以增强其免疫原性）或2.5×105~5×105细胞，免疫后3~4d即可取脾细胞进行融合。

取未经致敏小鼠脾细胞，加入含微量抗原、50%条件培养液及0.05mmol/L 2-巯基乙醇的营养液体外培养致敏。如系可溶性抗原取1~100ug，细胞抗原107个/20mL脾细胞悬液，细胞性抗原需经60Co照射或用固定剂短暂固定。

可采取体内和体外联合免疫法-即体内免疫采用脾内法，腹腔或皮下多点注射2~3次。融合前加强免疫改为体外诱导法。常规方法是取免疫过的小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用完全培养液悬浮细胞，加入rHulL-2、rHulL-6、PWM和特异性免疫原，使其终浓度分别为50U/mL、500 U/mL、1?200和500 ug/mL，置5% CO2，37℃温箱中培养5d后，收获细胞供融合用。

（二）杂交瘤选择

骨髓瘤是一种抗体生成细胞肿瘤，通常称浆细胞瘤（plasmacytoma）或骨髓瘤（myeloma），可合成瘤细胞本身的重链和轻链特异性免疫球蛋白。迄今，已有一系列适合于融合的小鼠系骨髓瘤细胞株，常用的小鼠骨髓瘤细胞系为SP2/0和NS-1，均来自BALb/c小鼠骨髓瘤。

复苏的瘤细胞需在含10%新鲜小牛血清的RPMI-1640培养液中，置5% CO237℃温箱培养，每2~3d换培养液一次，3~5d传代一次。在倒置显微镜下观察为圆形明亮，排列整齐，形态完整，密度适宜（0.1×106~1×106个/ml）。

经台盼蓝染色，活细胞数应大于90%时供细胞融合用。实验室培养的骨髓瘤细胞最好每隔3~6个月，将细胞在含有8-AG的培养液中培养一次，去除回复突变的细胞。

（三）细胞培养

在体外细胞培养中，单个或少数细胞不易生长与增殖，需加入其他活饲养细胞（feeder cell）共同培养，才可能使之生存。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞或大鼠胚胎传代纤维母细胞等。小鼠腹腔细胞含有巨噬细胞，除具有饲养作用外，还可清除残废破碎细胞及微生物。

取8~10周龄同系小鼠，断颈处死后，无菌操作腹腔注射10~15ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后，吸回腹腔液体，调整细胞浓度为1×105/mL，一般一只小鼠腹腔液可获取细胞3×106~5×106，可供一次融合用。

（四）细胞融合

免疫亲代脾细胞与骨髓留细胞在融合剂作用下，膜先行融合形成双核细胞或混核体（heterokaryoms），在下一次细胞分裂时，部分异核体在核融合产生杂交瘤(hybrids)子代。杂交瘤子代几乎是均等分获混核体的遗传物质。

细胞融合的方法有生物学方法（仙台病毒）、物理学方法（电场子诱导、激光诱导等）、化学方法以及受体指引型细胞融合法，最早的杂交瘤是用仙台病毒（Sendai virus）作为融合剂制备的，而目前用于细胞融合的诱导剂是聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）。

自Galfre等（1977）首次描述使用PEG促进髓瘤细胞融合以来，虽然有一些改进，但基本方法和原则均无大的改变。

（1）选好骨瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。

（2）取3d前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。断颈处死小鼠，浸泡于75%乙醇中3~5min。无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5×108~2×108个脾细胞。

（3）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1?5~1?10比例混合，加入20~50mL RPMI-1640液，1 000r/min×10min离心，弃上清，用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置37℃水浴中，吸取1mL37℃预温的50%PEG缓缓滴入离心管内，1min内加完。

37℃静置1min，滴加完全培养液（37℃预温）1mL，1min内加完，再加RPM1-1640液到50mL使PEC作用终止。800r/min×10 min离心，弃上清，将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的HAT培养液中，接种24孔或96孔培养板置37℃ 5% CO2温箱中培养。

（五）筛选克隆培养

经PEC处理后的两种亲本细胞，可形成多种细胞成分的混合体，包括未融合的游离亲本细胞、骨髓瘤细胞间的融合、免疫B细胞间的融合及骨髓瘤细胞与免疫B细胞间的融合的异地核细胞，仅后者可形成杂交瘤。

通常应用含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminoptenn，A）和胸腺嘧啶核苦（thymidine，T）HAT培养液予以筛选出来克隆培养，融合后每3~5d换一次HAT培养液，每次吸出出培养孔旧液1/2换入新液，连续2周。

3~5d后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1周左右可出现克隆，并不断增值，当集落大于3mm或布满孔底1/2时，即可取上清作抗体活性检测，同时补加新鲜HAT培养液。在一次较好的融合试验中，约70%~80%孔有克隆生长。所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。培养3W后即可改用普通完全培养液。

（六）杂交瘤阳性克隆的克隆化

杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性McAb的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同，因此，必须应用酶联免疫吸附试验（ELISA），间接血凝试验（PHA），放射免疫测定（RIA）、直接和间接荧光抗体技术（DFA、IFA）以及免疫酶斑点试验等进行筛选和克隆化。

首先初筛出能分泌与预定抗原起反应的McAb杂交瘤细胞，再进一步从中筛选出有预定特异性的杂交瘤细胞，然后选出可供实际应用，具有能稳定生长和有功能特性的细胞克隆。

为了防止无关克隆的过度生长，对阳性孔需进一步克隆化。常用的克隆方法有：有限稀释法（limiting dilution，LD）、软琼脂法、直接挑取法及荧光激活细胞分离仪（FACS）分离法。

有限稀释法是将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数。用HT培养液稀释，使细胞浓度为50~60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL（5~6个细胞/孔）。接种两排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种两排，如此类推，直至使平均每孔含0.5~1个细胞。

培养7~10d后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3~5次，直至达100%阳性孔即可，以确保抗体由单个克隆所产生。

软琼脂法是在琼脂糖凝胶（agarosegel）半固体培养液中使细胞增殖的方法。将杂交瘤细胞培养在软琼脂板上，待单个细胞形成群落后，再用吸管吸出，并轻轻吸上和吹下面打碎团块。将吸出的细胞移入小孔中继续培养。

显微挑选法是以显微操作术用微细吸管将单个克隆细胞细胞选出，分别进行培养。

FACS法是利用McAb、免疫荧光和激光原理对细胞进行定性或定量流式细胞光度分析与分离。分离后将选出的杂交瘤细胞放入96孔板中培养。

（七）McAb的制备

在细胞培养过程中杂交瘤细胞能产生和分泌McAb，但是一般产生的抗体量很少，约10~100ug/mL。近年来发展了各种新型培养技术和装置进行的体外培养法，包括用无血清培养液作悬浮培养法、中空纤维培养系统、全自动气升式或深居培养罐以及微囊或粒珠培养系统等。

在小鼠体内接种杂交瘤细胞，采取体内诱生法，制备腹水或血清。

腹水型McAb的制备可选择适当的健康小鼠，先于小鼠腹腔注射0.3mL降植烷（prisame）或石蜡油，7~10d后于每只小鼠腹腔注射阳性克隆的杂交瘤细胞0.5×108~5×108个。

待小鼠腹部明显膨大到一定程度时，用9号针头抽取腹水或用16号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心后，取上清分装，置-20℃保存备用。腹水出现快慢与注射细胞类型及小鼠的质量有关。注射细胞少，腹水出现慢，但抗体效价高；注射细胞过多，腹水出现快，但可出现血性腹水。

血清型McAb的制备可将对数生长期的杂交细胞于小鼠背部皮下多点注射，待肿瘤达到一定大小后（10~20d）即可采血，血清中McAb的含量可达1~10mg/mL。

（八）McAb鉴定

对产生抗体的细胞克隆，一方面检查其染色体数目，确定是否接近两种亲代细胞染色体之和（约80~100条）。另一方面，取其培养上清或诱生的腹水，检查抗体免疫球蛋白的类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量等。

杂交瘤细胞染色体的检查通常采用秋水仙素裂解法。McAb类型、亚型的测定通常以兔抗小鼠Ig类型和亚类的标准血清，采用琼脂双扩或ELISA夹心法测定McAb与抗小鼠Ig类型和亚类的反应性，以确定McAb属哪一类型和亚类。

McAb的特异性鉴定检测方法应该多样化，包括ELISA、免疫发光、放免荧光、放兔测定、间接血凝、印迹试验、抽滤斑点免疫结合法、化学发光免疫斑点法（Chemiluminescenec dot ?immunobinding assay，CDIA）以及各种结合抑制试验。

McAb的效价以培养上清或腹水的稀释度表示。在凝集反应中，腹水效价可达5×104；在ELISA或RIA中，腹水效价可达106，如低于105，该抗体用于诊断的敏感性将不高。

McAb抗体亲和力的测定对可溶性抗原可采用免疫深沉、快速ELISA、免疫荧光、RIA及其竞争抑制试验等；对细胞性抗原还可采用FACS测定。

一个抗原分子表面常有多个抗原决定簇，用该抗原制备的McAb有的是同一决定簇，有的则是抗不同决定簇，可用竞争抑制试验、相加指数法及微机集群分析等测定McAb所识别的抗原位点。McAb作用抗原的分子量常采用免疫印迹试验测定。

（九）杂交瘤细胞株的冷冻和复苏

克隆化和经鉴定的杂交瘤细胞株，或是一时来不及克隆化鉴定的杂交瘤细胞及时置-196℃液氮保存，以保持其特性和活性。

收集培养的杂交瘤细胞或从小鼠体内取出的杂交瘤细胞，加入一定量的细胞冻存液（30%~40%小牛血清，50%~%60%不完全PRMI-1640培养液，10%DMSO），使细胞浓度为1×106~ 5×106个/mL。

将细胞悬液分装到冻存管中，先置于-30℃冰箱1小时，再移置-70℃冰箱2小时以上或过夜，最后置液氮中，或将盛冻存管的不锈钢提筒先置于液氮罐口以5cm/5min速度下降，直至没入液氮内。杂交瘤细胞可-80℃低温水箱存活6~9个月，在-150℃深低温冰箱或-196℃液氮中可存活数年。

杂交瘤细胞的复苏培养可将杂交瘤细胞冷冻管从液氮中取出，立即投入38℃~40℃水浴中，待细胞悬液快速解冻后，将细胞用RPMI-1640液清洗2次，然后将细胞用RPMI-1640完全培养液配成细胞悬液滴入24孔培养板孔中或25mL培养瓶内。

置37℃，5%　CO2温箱培养。待复苏细胞生长良好时，2~3d传代培养。若冷冻后死亡细胞较多，可采用在培养瓶中加饲养细胞。在复苏冷冻前１d，于4孔培养板每孔中加小鼠腹腔巨噬细胞104/mL , 0.5mL。

（十）制备产生单克隆抗体的杂交瘤技术方法

[试剂配制]

（1）RPMI-1640培养基
A液：RPMI-164020.8% 、三蒸水1800.0mL。
B液：Hepes11.915g、三蒸水50.0mL。
将A液与B液分别溶解后，混合，补充三蒸水至1920mL，滤菌并分装100mL/瓶，4℃保存。

（2）无血清RPMI-1640培养基（SFM）。L-谷酰胺(200mmol/L)1.0mL(GIBCO LABORATOR产品已含L谷酰胺)、抗菌素液1.0mL(每100mL双蒸水中含有青霉素100万单位，链霉素100ug)、5%碳酸氢钠4.2mL、RPMI-1640培养基至100.0mL。

（3）完全RPMI-1640培养基。SFM80.0mL、灭活小牛血清（56℃，40min）20.0mL

（4）次黄嘌呤（H）氨塞喋呤（A）胸腺嘧啶核苷（T）选择培养基（HAT）。

1）氨基喋呤（A液）母液（100×）：氨基喋呤1.76mg、1N氢氧化钠0.5mL、双蒸水90mL，溶解后加1N盐酸0.5mL，加双蒸水至100mL，滤菌后分装1mL/瓶，-30℃保存。

2）次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT液）母液（100×）：次黄嘌呤（H）136.1mg、胸腺嘧啶核苷（T）38.8mg、双蒸水100.0mL，在45~50℃水浴中溶解，过滤除菌后分装1mL/瓶，-30℃保存。

3)HAT选择培养基：A母液1mL、HT母液2mL、完全RPMI-1640至100 mL

4）50%聚乙二醇（PEG）。

PEG（MW4 000Merck）10.0g置30 mL容量小烧瓶中，高压8磅15min,冷却至50℃时加入SFM 10 mL，混匀分装0.7 mL/管，-4℃保存。

5）细胞冻存保护液。

取二甲亚砜（DMSO）1.0 mL加灭活小牛血清9.0 mL。混匀后置4℃保存。

[操作步骤]

（1）取生长旺盛的Sp2/o骨髓瘤细胞置离心管内，室温或4℃离心1 000r/min×5min，弃去上清，换SFM洗3次，重悬于10 mL SFM中，用血细胞计数器计数。

（2）将脾细胞供体小鼠采血后拉颈处死，立即浸入70%乙醇中并移至杂交瘤实验室；在超净工作台内无菌操作取出鼠脾，置含冷SFM的平皿内；用尖嘴镊将脾脏分散为小碎块，用10 mL移液管吸取平皿内脾细胞，并使移液管与50 mL沉淀管呈90度角，将大块留在移液管内，可获分散满意的脾细胞悬液；离心1 000r/min×5min，重悬至30mLSFM内，计数。

（3）将1×102脾细胞与1×107Sp2/o瘤细胞置50mL离心管内，离心1 000r/min×5min，弃上清，再用SFM洗3次，轻击管底，并置37℃水浴温热15min。

（4）按下列步骤滴加在37℃水浴中预热的50%PBG溶液：第一分钟内滴加50%PEG溶液0.7mL，第二分钟内滴加37℃SFM1mL，第三分钟内滴加37℃SFM3mL，第四分钟内滴加SFM15mL，然后将SFM量增至50mL，离心800r/min×5min后，弃去上清，重悬于50mL完全RPMI-1640培养基；

将上述混合细胞悬液接种至2块24孔培养板，每孔1mL，再加入HAT（含20%灭活小牛血清），轻放入CO2培养箱，37℃ ，5% CO2条件下培养；融合后第3d，第7d，自每孔中吸出上清1mL，再添加HAT1mL；

融合后第10d，如见大量克隆生长，培养上清变黄，即吸出1mL上清检测抗体，培养中再替换入1mL HAT。一旦出现阳性生长孔，应立即进行克隆化操作；

（5）将阳性生长孔细胞混悬，同时双份传代和液氮冻存，并吸出0.1mL细胞悬液计数；

用完全RPMI-1640培养液将细胞悬液依次稀释为50个/mL，10个/mL，2个/mL；5个/0.1mL，1个/0.1mL，和0.2个/0.1mL；接种至96孔培养板，第1~2排；

5个/0.1mL/孔：第3排，1个/0.1mL/孔；第4~6排，0.2个/0.1mL/孔，置CO2培养箱内培养（37℃、5% CO2）；克隆化操作后5~6d，在倒置显微镜下检查，在只有一个克隆生长的孔盖上作记号。

第7d，添加完全RPMI-1640培养液0.1mL/孔；一般于第9~10d开始有部分培养孔上清变黄，此时吸取上清供抗体检测；阳性孔内细胞可移种至24孔培养板，同时液氮冻存。

待24孔培养板中细胞生长良好时（约占孔底1/2~1/3面积），还可移种至培养瓶中扩大培养（应用有限稀释法一次克隆化难以保证单克隆性，至少进行2~3次克隆化操作，再克隆时，96孔培养板内每孔细胞数可增至10个、5个和1个。通常再克隆化需在初次克隆后一个月进行。每次克隆后，阳性孔均需同时液氮冻存）。