单克隆抗体的制备

通过细胞融合技术（如 PEG 诱导法）将产生单一抗体的一种免疫动物 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种由单个克隆细胞产生的抗体分子称单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。经 HAT 选择培养基的选择，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得既能产生单一抗体、又能不断增殖的杂交瘤细胞系。这种细胞经过扩大培养，再接种于小鼠腹腔，即可在其腹水中得到高效价的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备原理是利用 HAT 选择培养基，只有融合成功的杂交瘤细胞（既具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力，又具有免疫 B 淋巴细胞合成分泌特异性抗体的能力）才能继续生长，通过免疫学检测和单个细胞培养，最终获得既能产生单一抗体、又能不断增殖的杂交瘤细胞系。

器材：

② 超净工作台

③ CO2 恒温培养箱

④ 倒置显微镜

⑤ 移液器

⑥ 灭菌眼科剪和小镊子

⑦ 细胞计数板、96 孔细胞培养板、灭菌 200 目滤网、直径 5 cm 灭菌平皿、10 cm 灭菌平皿、无菌尖吸管、10 ml 刻度离心管、50 ml 刻度离心管、一次性注射器

试剂：

① 材料：Balb／c 雌性小鼠（8～12 周龄）、骨髓瘤细胞系（SP2／0 细胞）

② 绒毛膜促性腺激素（免疫小鼠用）

③ RPMI-1640 培养液

④ HAT 培养液

⑤ HT 培养液

⑥ 台盼蓝染液

⑦ PEG-4000

⑧ 秋水仙素

⑨ 甲醇-冰醋酸

⑩ 吉姆萨染液

（5）3 d 后颈椎脱臼法处死小鼠，用 75％ 乙醇浸泡尸体 5 min。无菌条件下取出脾脏置于无菌平皿中，剔除周围的结缔组织，用无血清的培养液冲洗干净。用灭菌剪刀将脾脏充分剪碎，用玻璃组织匀浆器轻轻研磨成糊状，用 5～10 ml 无血清的 RPMI-1640 培养液制成细胞悬液。经灭菌 200 目滤网过滤入平皿中，制成脾细胞悬液，移入离心管。

（6）800 g 离心 5 min，弃上清液，用不含血清的 RPMI-1640 培养液清洗并离心 2 次。用 10 ml 完全 RPMI-1640 悬浮细胞，计数并用台盼蓝测活（应 > 80％），调整细胞浓度至（0.5～2）x108 个/ml，冰浴备用。

（三）骨髓瘤细胞准备

（1）用含 20％ 小牛血清的 RPMI-1640 培养液扩大培养 SP2/0 细胞。

（2）于融合当天镜检选择生长旺盛、细胞形状规则、大小均匀、轮廓清晰的瘤细胞作融合用。

（3）收集瘤细胞，800 g 离心 5 min，弃上清液。用培养液清洗细胞 2 次，计数并用台盼蓝测活（应＞95％），调整细胞浓度至（1～5）x105 个/ml。

（四）饲养层细胞的制备

（五）细胞融合

（1）取 1～2 ml 骨髓瘤细胞和 10 ml 脾细胞于 50 ml 离心管中混合（脾细胞：骨髓瘤细胞为 4:1～10:1，多用 5:1），800 g 离心 5 min，尽可能地弃尽上清液（沉淀细胞尽量少含水分，以免使 PEG 稀释）。轻弹管底，使沉淀细胞略松动。置水浴锅中 37 ℃ 预温。

（2）取 1 ml 50％ PEG（37 ℃ 预温），用滴管沿管壁逐滴缓慢加入，边加边轻轻用尖吸管吹打混匀，1 min 内加完。37 ℃ 静置 90 s。

（3）缓慢加入 20 ml 37 ℃ 预温的无血清的培养液（开始 1 ml 一定要缓慢逐滴加入，之后可以稍快，但动作一定要轻柔），以终止融合。轻轻温和混匀，以免破坏新形成的融合细胞。

（4）迅速以 800 g 离心 5 min，弃上清液。加 12 ml HAT 培养液，轻轻混匀后滴加于预先铺有饲养细胞层的 96 孔板中，每孔 50 μl，置 5％ CO₂ 培养箱中 37 ℃ 孵育。

（六）融合细胞的选择性培养及杂交瘤细胞的筛选

（1）融合细胞培养 3 d 后，用倒置显微镜观察其生长情况。可观察到未融合的细胞开始死亡，细胞质中出现粗颗粒，细胞逐渐固缩破碎。杂交瘤细胞则开始成堆生长，并分裂增殖。

（2）间隔 2～3 d 观察 pH 值、污染及克隆生长等情况。动作要快，以防 pH 值和温度变化而影响克隆生长。自融合始，每隔 3～4 d 半量换 1 次 HAT 液，以补充营养和核酸合成旁路的原料（次黄嘌呤和胸腺嘧啶）。至第 10～14 d，以 HT 培养液逐步替代 HAT，进行半量换液。

（3）当细胞集落长至 1/5～1/3 孔时，收集上清液进行特异性抗体检测，选出杂交瘤细胞生长旺盛、抗体反应强的做克隆化培养。如阳性孔的细胞集落较大，可吸出一部分移入已加有巨噬细胞的培养瓶中继续培养，多余的细胞可冷冻保存起来。

（七）杂交瘤细胞的克隆化培养

（1）取杂交瘤细胞于刻度离心管中，计数活细胞。取细胞悬液 0.5 ml，加 HT 培养液至 5 ml，每次做 10 倍稀释，直至杂交瘤细胞的终浓度为 5～10 个/ml。取 0.1 ml 细胞悬液于预先铺有饲养层细胞的 96 孔板中（克隆前一天铺板），使每孔理论上含 0.5～1 个细胞。

（2）置 CO2 培养箱中培养，每 2～3 d 半量换液 1 次，隔日观察并记录细胞生长情况。约 9～10 d 检测培养液上清液。将分泌特异性抗体强的杂交瘤细胞再次挑出，按上述方法做第二次、第三次克隆化培养。一般当每孔平均有 1 个细胞时，大约有 37％ 的孔有细胞生长。经 3 次克隆化的杂交瘤细胞其特异性抗体检出阳性率可达 100％。一般要求经 5 次以上的克隆化和连续 3 次特异性抗体检出阳性率为 100％ 后，扩大培养，正式建株。

（八）杂交瘤细胞的鉴定

可采用染色体计数法进行杂交瘤细胞的鉴定，杂交瘤细胞的染色体数目接近两种亲本细胞即小鼠脾细胞的染色体数目（40 条）与 SP2/0 细胞的染色体数目（62～68 条）之和。在稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系中，具有相同染色体数（众数）的细胞比例较高。通过染色体分析可以深入了解杂交瘤细胞的染色体众数在持续培养中的动态变化，从而更好地把握杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性及克隆化培养的最佳时机。

（1）取杂交瘤细胞 1x105 个/ml，加入秋水仙素 0.2 μg/ml，37 ℃ 培养 2～4 h。

（2）取出后，以 1000 g 离心 8 min，弃上清液，加入 0.075 mol/L KCl 溶液 6～8 ml，立即用吸管将细胞团吹散打匀。室温下静置低渗处理 20 min。

（3）低渗处理细胞后，以 1000 g 离心 8 min，弃上清液，沿管壁加 6～8 ml 新配制的甲醇-冰醋酸（3:1）固定液，立即用吸管轻轻吹打混匀。静置固定 30 min。1000 g 离心 8 min，弃上清液。然后重复固定、离心 1 次。

（4）用新配制的甲醇-冰醋酸（1:1）固定液再固定 20 min 后，1000 g 离心 8 min，弃上清液。

（5）加适量（约 5 倍于细胞体积）的甲醇-冰醋酸（1:1）固定液，制成细胞悬液。滴片、自然干燥，吉姆萨染液染色，镜检并进行染色体计数。具有众数的细胞所占的比例愈高，细胞株分泌抗体的稳定性愈大。

（2）本实验应严格无菌操作，避免细菌、霉菌，特别是支原体的污染。

（3）用于杂交瘤的培养液多采用 RPMI-1640 和 DMEM 作为基础液。

（4）饲养层细胞（巨噬细胞）加入的量和时间对杂交瘤细胞的生长影响明显。应结合不同的抗原系统、不同的实验条件，通过反复实验而定。

（5）由于杂交瘤细胞集落中可混有不分泌抗体的克隆，且其生长速度快于分泌抗体的克隆，故应及早进行抗体检测和克隆化培养以鉴定。

（6）饲养层细胞通常选用小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔细胞（主要含巨噬细胞）。常用小鼠的腹腔细胞，不仅可吞噬清除死亡细胞，而且可供给杂交瘤细必要的生长条件，但不能用激活的巨噬细胞。