B 淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体
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简介
B 淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体是德国免疫学家乔治•吉恩•弗兰茨•科勒（Georges J.F.Köhler）和英国分子生物学家塞萨•米尔斯坦（Cesar Milstein）于 1975 年创建，开创了抗体制备的新纪元，为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的工具，促进了免疫学、基础与临床医学等众多学科的发展，Köhler 和 Milstein 也因此杰出贡献而荣获 1984 年诺贝尔医学或生理学奖。
原理
B 淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理是采用细胞融合技术，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，从而使后者可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体，图解示意（图1-2）。
材料与仪器
器材：烧杯、眼科剪刀和镊子、玻璃平皿、不锈钢筛网（200 目）、50 ml 离心管、刻度吸管（1 ml 和 10 ml）、弯头滴管、5 ml 或 10 ml 注射器（以上物品均经高压灭菌），血细胞计数板。
试剂：
① RPMI 1640 不完全培养液，
② 0.1％ 锥虫蓝染液；
③ 75％ 乙醇
④ 20％ 小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液
⑤ 20％FCS－RPMI 1640 完全培养液
⑥ 45％ PEG（分子量 4000，含 5％ DMSO）
⑦ 0.1％ 锥虫蓝染液
步骤
B 淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本过程可分为如下几步：
（一）动物免疫
选择合适的免疫方案，并对动物进行免疫
1．脾内免疫法
A 乙醚麻醉小鼠，右侧卧位置于动物固定架上，暴露左肋部及部分脊背部。
B 碘酒、酒精消毒后，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜可清楚地看到脾脏。
C 取已吸有抗原的注射器（配 4 号针头），沿脾脏纵轴方向由一端刺入直至另一端。
D 注意应使针头尽量在脾脏深部，切勿穿透。然后边出针边注入抗原（0.1 - 0.2 ml），至出口处稍停片刻，以防抗原渗出。注射完毕后可将切口缝合，也可不缝合，但须在切口上、下缘皮毛上涂抹少许医用黏合剂或万能胶水（如 502 胶等），然后捏合皮毛，覆盖切口。
2．体外免疫
A 取 4-8 周龄 Balb/c 小鼠脾脏，制成单细胞悬液
B 用无血清培养液离心洗涤 2 次，重悬于 10％ 胎牛血清培养液 C 再加入适量抗原（参考剂量：可溶性抗原 0.5-5 μg/ml，细胞抗原 105 - 106 个细胞/ml）和一定量的 Balb/c 小鼠胸腺细胞培养上清（作为条件培养液提供细胞因子）D 在 37℃、5％ CO2 浓度下培养 3-5 天后，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
（二）细胞融合
骨髓瘤细胞
A 取体外培养的骨髓瘤细胞皮下注射于 Balb/c 小鼠背部两侧，每部位注射 10-106 个细胞。
B 待肿瘤生长至直径 2-3 cm 时，无菌摘除肿瘤，用剪刀剪成小块，再用注射器内芯研磨、挤压出肿瘤细胞。
C 细胞经洗涤液洗涤一次后，加入比重为 1.077 的淋巴细胞分离液，400 g 离心 15 分钟，收集界面层的骨髓瘤细胞，洗涤 2 次即可用于融合。
免疫脾细胞
A 经过免疫的 Balb/c 小鼠拉颈或 CO2 处死，于 75％ 乙醇中浸泡 5 分钟，超净台内无菌开腹取出脾脏，以 5 ml RPMI 1640 不完全培养液轻洗一次。
B 在盛有 20 ml 不完全培养液的平皿中放置不锈钢筛网，并将脾脏移入筛网上，用注射器内芯轻轻研磨脾脏，吸取平皿内培养液轻轻冲洗不锈钢筛网，使脾细胞全部通过网孔进入到溶液中。
C 将上述脾细胞溶液转移至 50 ml 离心管中，加不完全培养液 15-20 ml，混匀；1200 r/min 离心 10 分钟，弃上清。
D 细胞沉淀再用不完全培养液同法离心洗涤一次后重悬，锥虫蓝染色做活细胞计数（脾细胞中混有部分红细胞不影响融合率，故无需去除）。一般免疫鼠脾脏体积约为正常鼠脾脏体积的 2 倍，每只小鼠可得 1.0×10-2.5×10 个脾细胞。
（三）饲养细胞
以小鼠腹腔巨噬细胞的制备为例详述饲养细胞的制备。
A 常用与免疫小鼠相同的品系（如 8 － 10 周龄 BALB/c 小鼠）。
B 将小鼠拉颈处死后浸泡于 75％ 酒精消毒 3 -5 min，用无菌 剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。
C 更换一套无菌剪刀和镶子，用镶子提起腹膜剪一小口，用 弯头滴管注入 3 ml 不完全培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。重复 1 次。
D 放入 10 ml 离心管，1200 r/min 离心 6 min
E 用 20％ 小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬， 调整细胞数为 1×105 ml－1。加入 96 孔板，每孔 100μL。放入 37℃ CO2 孵箱培养。
注意事项：一般饲养细胞在融合前 Id 制备，每只小鼠可 获得（5 - 8）× 106 个腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细 胞时，细胞浓度为 5 ×l06 mL－1，小鼠脾细胞为 1 × 106 mL－1，小鼠的 成纤维细胞（3T3）1 xlO＇mL，均为每孔 100μL（四）免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
A 取对数生长的骨髓瘤细胞 SP2/0，1000 r/min 离心 5 分钟，弃上清，用不完全培养液重悬细胞沉淀，混匀后锥虫蓝染色作活细胞计数，取所需细胞，用不完全培养液洗涤 2 次。
B 取上述制备的免疫脾细胞用不完全培养液洗涤 2 次。
C 将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1：10 或 1：5 的比例加入同一个 50 ml 离心管内，补加不完全培养液至 30-40 ml，充分混匀。
D 1200 r/min 离心 8 分钟，弃上清（用滴管尽量吸净残留液体，以免影响 PEG 的浓度）。
E 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松散呈均匀糊状。
F 室温下融合：
①一手均匀地转动离心管，另一手用 1 ml 吸管吸取 37℃ 预热的 45％ PEG 1 ml，并沿转动的离心管管壁均匀、缓慢地加入（尽量接近细胞处），时间控制在 60 秒左右，然后立即轻柔地将细胞悬液全部吸入吸管（时间控制在 30 秒左右），静置 30 秒，再将其轻柔地吹入离心管内（时间也控制在 30 秒左右）。
②立即在 5 分钟内按每分钟 1、2、4、8 和 10 ml 的体积（共 25 ml）加入预热至 37℃ 的不完全培养液，通过稀释 PEG 而终止其促细胞融合作用。
G 800r/mim 离心 6 分钟，弃上清，加入适量 20％ FCS－RPMI 1640 完全培养液轻轻混悬融合细胞，切勿用力吹吸细胞。按 10 ml 一块 96 孔细胞培养板计算完全培养液用量。
H 将融合后的细胞悬液加入已铺有饲养细胞的 96 孔细胞培养板中，100μl/孔，37℃、5％ CO2 孵箱培养。通常 1 只免疫鼠脾细胞融合后可加 4-6 块 96 孔板。
注意事项：
1. 融合时一般将小鼠脾细胞数量固定在 10 个，而骨髓瘤细胞数量则可取 1x10 - 3x10 个（脾细胞和骨髓瘤细胞数比例在 10：1-5：1）。
2. PEG 的分子量和浓度可影响融合效果。实验表明，平均分子量为 400-6000 的各种 PEG 在 10％ - 60％ 浓度范围内都能使细胞发生融合，但融合率高低则因其分子量和浓度的不同而有差别。一般来说，PEG 的分子量和浓度越大，其促融率越高，但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。另外，在配制 PEG 时，常加入 5％-7.5％ 的二甲基亚砜（DMSO）做保护剂，这样既可减轻 PEG 的毒性，又可缩短融合时间，提高融合率。
3. 加 PEG 时除时间掌握准确外，还应注意手法要均匀、缓慢、轻柔，在 PEG 加入后的系列操作中更应轻柔，以免干扰细胞融合过程和损伤融合后的细胞。
4. 若冬天进行细胞融合，室温较低时，在加入 PEG 后，可将作用时间从 90 秒延长至 120 秒。
（五）融合细胞的选择性培养
A 通常在细胞融合后的 24 小时内，于含有融合细胞的 96 孔细胞培养板中加入 HAT 选择培养液。
B 目前 HAT 和 HT 均有 50x 商品化试剂，因此用时以 20％ FCS－RPMI 1640 完全培养液做相应稀释，保证 HAT 或 HT 的终浓度为 1x 即可。
C 培养 3 天后第 1 次换液：吸弃 2/3 陈旧培养液，加入等量 1xHAT 新鲜培养液（稀释于 20％ FCS－RPMI 1640 中）。
D 继续培养 3 天后第 2 次换液：吸弃 2/3 陈旧培养液，用 HT 替换 HAT，即加入等量 1xHT 新鲜培养液（稀释于 20％FCS－RPMI 1640 中）。
E 重复上述步骤继续培养就可进行阳性杂交瘤的筛选。
注意事项：细胞融合后，须每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况：
1. 融合当天（第 1 天）：可见骨髓瘤细胞透亮，形态多样，相互之间有粘连、重叠，并可见到巨细胞或哑铃状细胞。
2. 融合后第 3 天：骨髓瘤细胞数量锐减，出现大量破碎细胞，其折光性差，呈暗黑、皱缩状；同时可见少数形态良好、透亮的细胞，但尚不能判定其性质。
3. 融合后 4-7 天：骨髓瘤细胞几乎全部消失，在贴壁饲养细胞（巨噬细胞）周围可见许多大小不等的细胞碎片聚集；另见形似骨髓瘤细胞、浑圆透亮、呈葡萄串状分布的融合细胞小集落克隆形成，集落中细胞数多少不等、增殖迅速。
4. 融合后第 7-10 天：细胞克隆快速增大，当其覆盖面积达培养板孔底 1/4 - 1/3 时，即可取培养上清进行检测以筛选阳性杂交瘤。
5. 对检测出特异性抗体的孔内细胞应及时转种并进行克隆化。对检测结果为阴性的孔，如考虑是因细胞克隆尚小、分泌抗体较少的缘故，可隔 2 日再检测一次；如仍为阴性，则可弃去。
（六）单克隆细胞株的筛选与克隆化
以最常用的有限稀释法为例：
A 于克隆化前一天或当天制备饲养细胞（同融合前准备），铺入 96 孔细胞培养板，100μl/孔。若为第一次克隆化，饲养细胞应采用含 HT 的条件培养液重悬。
B 用毛细滴管在显微镜下无菌吸取阳性克隆，放入试管中轻轻吹打混匀细胞，计数。
C 取 100 个细胞移入 10 ml 20％ FCS － RPMI 1640 完全培养液（若为第一次克隆化，则用含 HT 的条件培养液），混匀后加入含饲养细胞的 96 孔培养板中，100μl/孔。如此，平均每孔种入 1 个细胞。
D 置 37℃、5％ CO2 孵箱中培养，4 - 5 天后即可在倒置显微镜下观察到小的细胞克隆形成；第 7 - 9 天时，于细胞培养板底部肉眼可见细胞克隆，应及时进行抗体检测。
E 尽量选择单克隆孔进行抗体检测，如果所选检测孔中有抗体检测阴性孔，则需选择阳性单克隆孔继续上述克隆化步骤，直到所有检测孔全部为抗体检测阳性为止。
注意事项：
1. 由于抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌细胞的生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌细胞丢失，因此，细胞融合后第一次克隆化的时间应尽可能早。一旦形成的杂交瘤克隆被检测为抗体阳性，则不论其细胞克隆大小，均应立即进行克隆化，这是保证克隆化成功、获得稳定分泌 McAb 杂交瘤细胞系非常重要的一环。此外，即使克隆化过的杂交瘤细胞，如果发现其分泌抗体的能力有所减弱，也需重新进行克隆化。
2. 由于融合过程中杂交瘤细胞是在 HAT 选择性培养液中生长，增殖能力比亲本骨髓瘤细胞弱，因此，在第一次克隆化时应使用含 HT 的条件培养液，以提供足够的嘌呤和嘧啶核苷，后续克隆化可用不含 HT 的普通培养液。
3. 由于单个杂交瘤细胞难以存活，克隆化时仍需加入饲养细胞。用做克隆化的饲养细胞可以是小鼠的腹腔巨噬细胞，也可是小鼠的胸腺细胞。
4. 为确保克隆化成功，在克隆化时可设置不同细胞密度，如每 ml 分别含 40、20、10 和 5 个细胞，这样每孔分别含 4、2、1 和 0. 5 个细胞，每个细胞密度做半块 96 孔细胞培养板。
5. 一般融合后的杂交瘤要经过至少 3 次以上的亚克隆化，且单克隆孔的检测阳性率须达到 100％ 为止。此外，每次克隆化得到的阳性亚克隆，在继续进行克隆化或扩大培养的同时，应及时液氮冻存以保种。
注意事项
在单克隆抗体制备过程中，由于实验周期长、环节多，因此其成败会受到多种因素的影响。以下将列举主要影响因素、分析造成失败的可能原因并给出相应解决方案：
（一）微生物污染
包括细菌、真菌和支原体的污染，这是整个杂交瘤细胞培养工作中最棘手的问题。细菌和真菌的污染可能因实验者操作不当或实验环境洁净度不够造成，而支原体的污染则主要来源于牛血清，此外，其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，最好对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体检查，对污染的杂交瘤细胞可通过两种方法予以清除：
①购买商品化去支原体试剂加入被污染杂交瘤细胞培养体系共培养；
②采用生物体内过滤法，即将污染的杂交瘤细胞注射于同系小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，无菌吸出腹水或剥离实体瘤，然后分离杂交瘤细胞。
（二）融合后杂交瘤不生长
在保证融合过程没有失误的前提下，主要考虑下列因素：
①PEG 产品纯度不够有毒性或作用时间过长；
②小牛血清的质量不好，用前没有进行严格筛选；
③骨髓瘤细胞可能污染了支原体；
④HAT 条件培养液中可能 A 含量过高或 HT 含量不足。
（三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
1．细胞融合后虽有杂交瘤细胞生长，但检测不到抗体产生：
①可能是抗原的免疫原性弱，或免疫方案不好，不能诱导有效的体液免疫应答所致；
②也可能是准备免疫脾细胞时操作不当，使较脆弱的抗原特异性淋巴母细胞损伤死亡。
2．有时可出现早期分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性：
①可能是 HAT 条件培养液中的 A 失效，不能有效抑制骨髓瘤细胞及其同核体的生长，导致杂交瘤细胞的生长受到抑制，最终消亡。
②骨髓瘤细胞发生突变，从 HGPRT 表达阴性变为阳性，而抵抗 HAT 中 A 对其的选择，可通过定期对骨髓瘤细胞进行 8－AG 筛选予以解决。
③染色体丢失。
④支原体污染。
为防止杂交瘤细胞变为阴性或停止抗体分泌，1982 年 Goding 等提出「三要」、「三不要」原则，
即三要：
①要确保液氮冻存的杂交瘤细胞建系原始管达到一定数量，如已使用，须进行补充；
②要应用倒置显微镜经常检查杂交瘤细胞的生长状况，以便及早发现细胞生长异常或病原微生物污染；
③要定期进行再克隆化，防止不稳定杂交瘤细胞的染色体丢失，或因克隆化不彻底所致抗体非分泌细胞的竞争性生长。
三不要：
①不要让细胞「过度生长」，因为不纯的杂交瘤细胞中，抗体非分泌杂交瘤细胞具有生长优势，将抑制抗体分泌杂交瘤细胞的生长；
②不要让杂交瘤细胞在无监测情况下体外连续培养几周或几个月，易发生病原微生物的污染；
③不要未经克隆化即让杂交瘤在动物体内以肿瘤生长形式进行连续传代，不仅可导致抗体非分泌细胞的竞争性生长，也易造成杂交瘤细胞染色体的丢失。
（四）杂交瘤细胞难以克隆化
小牛血清的质量、杂交瘤细胞的活性状态及是否被支原体污染等因素，都可能影响克隆化的成败。因此，在准备克隆化前，应对不同来源的小牛血清进行筛选，选取质量最优者应用。此外，融合后的第一次克隆化，仍需采用含 HT 的条件培养液。由于白细胞介素（IL）－6 可刺激 B 细胞、B 细胞杂交瘤的生长、分化及抗体分泌，因此，当杂交瘤细胞克隆化比较困难时，可在克隆化培养体系中加入适量 IL－6。
来源：丁香实验
