制备单克隆抗体的基本技术
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(一)抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×10 7 个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。
(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×10 5 /ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为210 5 /ml,次日一般即为对数生长期细胞。
图11-2杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程
对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取1×10 7 个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫3~4只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2~3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3~4天,分离脾细胞融合。
(二)骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×10 5 /ml,倍增时间通常为10~15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于95%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为210 5 /ml,次日一般即为对数生长期细胞。
图11-2杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程