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    用于分子细胞遗传学的人工细菌染色体资源库

    相关实验：用于分子细胞遗传学的人工细菌染色体资源库实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    TB 培养基 RNase 溶液 DNA 提取试剂盒 苯酚 琼脂糖 细胞培养基 Hank 平衡盐溶液 胸腺嘧啶 秋水仙胺 低渗溶液
    荧光显微镜 冷CCD照相系统 相差显微镜 玻片电热板 分光光度计 水浴摇床 恒温培养箱 冰冻载玻片

    步骤

    3 . 1 中期染色体制备和选片（见注释5) 1 . 人外周血淋巴细胞在细胞培养基中37°C培 养 72h 。 2 . 加 入 5-溴 脱 氧 尿 嘧 啶 （0.8mg/mL) 处 理 16h ，将细胞阻断在S 期 。 3. HBSS (H ank平衡盐溶液）洗细胞一次，除去阻断剂，加 入 含 2. 5mg/ m L 胸腺嘧啶核苷的细胞培养基，继续培养6h 。 4 . 收 获 前 IOmin加 人 0. l ^g/m L 秋水仙胺，收获的细胞用0. 075mol/L KCl 于 37°C低渗处理15min，使用新鲜配制的固定液反复固定4 次 。 5 . 制备高质量的染色体片子：将一滴细胞悬液自Im 高处摔落在乙醇处理过 的玻片上，使中期染色体分散，接着在一个装满接近沸腾的水容器上放置20〜 40s (可随环境湿度和具体染色体情况调整熏片的时间） 。每张染色体片应经过相 差显微镜检查，如果在分散的中期周围残存可见的细胞质，将剩下的细胞悬液用 固定液反复洗涤再滴片。理想的染色体中期分裂相应均匀分散，染色体致密、形 态 清 晰 （见 注 释 6)。如果染色体形态模糊或有毛边，说明熏片时间过久。制好 的片放置室温下，暗处保存2〜3 周 ，随后保存在一70°C备用。 6. FISH 实验前，应 在 相 差 显 微 镜 （IOX) 下阅片，选择杂交区域，保证一 个视野内至少有5 个分散好的中期，用玻璃笔标出杂交区域。 7 . 如果片龄超过2 周 ，通常省略RN A 酶处理，这并不会影响信噪比。如果 需 要 RNA 酶处理，则 于 37°C加 IOOjLtgAnL的 R N A 酶处理、 30min，之后经系 列 乙 醇 （7〇%、 9 0 % 和 1 0 0 % ) 脱水后备用。 3.2 BAC DNA提 取 （见注释7) 下 列 所 用 试 剂 购 自Qiagen，用 于 制 备 20〜 50哗 DNA (QIAGEN plasmid
    Midi/Maxi kit) , 也可根据生产条件的不同选择NucleoBond BAC Miniprep kit 或 NucleoBond BAC Maxi kit (ClonTech) 〇 1. LB琼 脂 平 板 （12. Si^gAnL氯霉素）划菌， 37°C培养过夜。 2 . 挑取单克隆，接 种在IOOmL LB (12. SjUgAnL氯霉素）中 37°C培养过夜。 测 定 O A 。。为 1.4〜1.6。 3•转入250m L 离心瓶， 3000g•离心菌液15min。 4 . 在 IOmL RN A 酶溶液中重悬菌液，将菌团完全打散，转 入 Oak Ridge管 中 （Allegiance)。 5 . 加 入 IOmL 0. 2mol/L NaOH /1 % SDS溶 液 ，轻 柔 缓 慢 地 颠 倒 1 0 次 ，混 匀溶液，室温静置5〜lOmin，确定溶液从混浊变澄清。 6 . 加 入 8m L 冰 冷 的 3mol/L 乙 酸 钾 （ pH 5. 5)，缓 慢 地 颠 倒 1 0 次 ，混匀溶 液 （用力过猛可能污染大肠杆菌的基因组DNA) ，冰 上 放 置 15min。 7. Sorvall RC 28S 离 心 机 ， SS34 转 子 （8 管 ）或 SA-600 转 子 （12 管） ， 4°(3， 33 000^'或 更 大 转 速 （16 000]： /111丨11， 8八-600)离心30111丨11，迅速移出 上清。 ‘ 8 . 用 25m L 吸 管 小 心 的 移 出 上 清 ，避 免 吸 出 沉 淀 ，上清移入干净无菌的 Oak Ridge 管中。 9 . 按照步骤6 再次离心。即使上清液非常澄清，但为了防止柱子的堵塞最 好做此步。将上清转入50m L 管中，冰上保存。 10. 用 4mLQBT 缓冲液平衡 “Qiagen-100” 柱 。 11. 将上清上柱。 12. IOmL Q C 缓冲液洗涤Qiagen-IOO柱 2 次 。 13. 60°C下 用 5m L Q F 缓冲液洗脱DNA，将洗脱液收集到已加入5m L 异丙 醇 的 14m L 培 养 管 （VWR，目录号60818-725)中。 14. 4°C ， 11 700g 离心 30min。使用 Sorval SA-600 转 子 ， 9000r/min〜 11 700g 离心。 15. 用 5mL 7 0 % E tO H 于室温下洗涤沉淀，再 次 离 心 lOmin，小心地倒掉 上 清 ，空气 干 燥IOmin (这一步可以除去BAC D N A 中多余的盐） 。 16. 加入40(V L T E ，用切掉末端的枪头吹打重悬DNA，因 为 BACDNA很 大 ，所以需要较长的时间完全重悬DNA，也 可 以 将 管 在 室 温 下 放 置 过 夜 ，使 DNA完全溶解。随后，将 DNA转 入 I .5mL Eppendorf管中。 17. 加 入 ^OOjLtL 苯 酚 ：氯 仿 （1 : 1)，振荡混匀，在微型离心机上最大转速 离 心 5min (见 注 释 7)。 18. 将上边的水相转入干净的I .5mL Eppendorf管中。 19. 加 入 40；xL 3mol/L NaOAc和 1 1 0 0 , 冰冷的无水乙醇，一20°C放 置 2h ， 沉 淀 DNA。
    20. 最大转速离心30min，用 75CVL冰冷 的 7 0 % 乙醇洗2 次 。 21. 用 5(^L T E 缓冲液溶解沉淀，可 在 4°C保存；如果沉淀团块比较大，在 37°C条件下放置过夜。 22. 预计产量为20〜50邶，在 5(^L 体积中浓度为0.5〜l ^g/pL。 23. 紫外分光光度计或荧光光度计确定BAC D N A 的产量。用琼脂糖凝胶电 泳确 定BAC的完整性。 3 . 3 探针 DNA标 记 （见注释8) 下述实验步骤采用缺口平移试剂盒（Nick-translation kit) (Gibco-BRL Life Technologies)0 1. 在 5 种 dN TP混合物中选择适合的dN TP混 合 物 （含除了用生物素或地 髙辛标记的dN TP外的所有的dNTP) ，放在冰上融化。 D N asel/D N A 聚 合 酶 I 放在冰上或一 20°C备用。 2 . 将 I .5mL Eppendorf管放置冰上，加入下述试剂： 5；xL dN T P 混 合物、 XpL BAC DNA溶 液 (含 有 I i^g DNA)、 I y L 地高辛-11-dUTP (用于地高辛标 记)、 蒸馏水将总体积调至42斗，稍混匀。 X 和 Y 的数量由DNA 的浓度决 定。 3 . 加 入 5^xL DNase I/D N A 聚 合 酶 I 混 合 物 和 1/1000稀 释 的 DNase I (3mg/mL)。轻柔但充分地混匀，离心机上离心5s ，将挂壁的液滴甩下来。 4. 15°C孵育 60min。 5 . 取 5；^ 上述的标记溶液， 1 . 2 % 琼脂糖凝胶电泳，与 Ikb DNA marker对 比，确 定 DNA片段的长度。 6 . 若 片 段 长 度 为 100〜500bp，则 加 入 SpL终 止 缓冲液；若片段长度大于 500bp，则 加 入 1/100稀 释 的 DNase I (3mg/mL)，继 续 孵 育 15〜40min (时间 长度根据D NA 片段的长度确定） 。 7 . 未结合的核苷酸采用层析（ Sephadex G~50)分离或乙醇沉淀。 3.4 FISH 3. 4.1 .杂交 1. 67〜70°C变性液中变性染色体片子IOs〜2min (见 注 释 6)。 2. 0 . 1 倍 体 积 的 3mol/L 乙 酸 钠 和 2 . 5 倍 体 积 的 冰 冷 的 1 0 0 % 乙醇沉淀 100〜200哗 探 针 D N A 、 3 ju g C o t -lD N A 和 7哗 鲑鱼精子D N A 。 用 IOjuL杂交液 重悬沉淀。
    3. 75°C水浴变性探针5min， 37°C水浴中预复性30min。 4 . 经变性并预复性的IOpL探针加到变性过的染色体片子上，盖上盖玻片， 轻轻挤压除去气泡，橡皮泥封片。 5 . 片子放在湿盒中37°C杂交过夜。 3 . 4 . 2 杂 交 后 洗 脱 和 检 测 （见 注 释 9) 1 . 在装 有 2XSSC/ 5 0 % 甲酰胺洗液的44°C的水浴中，洗 片 4 次 ，每 次 5min (直接标记的探针，在此步后可直接进行后面的染色体复染） 。 2. 50°C水浴摇床， 0. IX S S C 中洗片3 次 ，每 次 5min。 3 . 片 子 的 杂 交 区 域 加 上 IOOiLtL封 闭 液 （4 XSSC/ 3 % BSA/0.1% Tween- 20) ， 盖上 22mmX 50mm 的盖片， 37°C湿盒孵育 20min。 4 . 移去盖片，迅速甩掉封闭液，加上检测溶液。生物素标记的探针，使用 亲和素-FITC G pg/m L 溶于 0 •4^g/mL 4 XSSC/l % BSA/0. 1 % Tween-20);地 高辛标记的探针，使用山羊-抗地高辛抗体（〇 .知 g/m L 溶 于 0.知 g/mL 4 XSSC/ l % BSA/0. l % Tween-20) o 5 . 加上检测溶液的杂交区域盖上盖片， 37°C湿盒孵育30min。 6 . 移 去 盖 片 ，于 42°C下 在 2 X SSC (0.1% Tween- 2 0 ) 中 洗 片 3 次 ，每 次 5min〇 3 . 5 染色体复染（R 带）（见注释10) 为了同时观察染色体带型和F IS H 信 号 ，采 用 了 色 霉 素 A3 (chromomydn A3 ) 和偏端霉素A (distamycinA) 作为复染剂。比 起 DAPI染 色 得 到 的 Q 带 ， 这 种 R 带的带型更加清晰、可稳定重复。尽 管 CA3 和 F IT C 的发射光谱有部分 重 叠 ，但是可以通过适当的滤光片分别观察。 1 . 在 1/2 McIlavane缓 冲 液 （ pH 9 . 0 ) 中漂洗标本，甩掉多余液体。 2•标本上滴加 IOOjuL CA3 (0. 5mg/mL 溶于 5 0 % McIlavane 缓 冲 液 ， pH 9. 0)，室温染色40〜60min。 3 . 在 5 0 % McIlavane缓冲液中，室 温 洗 片 lm in，甩掉多余液体。 4 . 标本上滴加50jliL 0. lm g/m L 偏 端 霉 素A ，室温染色1〜2min。 5 . 在 1/2 McIlavane缓冲液中漂洗片子10〜20s 。 6 . 加上一薄层的抗淬灭剂，盖 上 盖 玻 片 （20mmX 50mm)。 3 . 6 显微阅片和图像分析（见注释11) 1 . 分析原位杂交片子可采用两种不同的Zeiss荧光显微镜进行肉眼观察、拍
    照 ，或者电子图像捕捉结合数字图像处理。单 色 F IS H 产生的黑白图像采用 Zeiss Axiophot 100 显 微 镜 ， Kodak Technical pan ASAlOO 黑 白 胶 片 拍 摄 。单 色 、双色或多色FISH 实验中，采 用 Zeiss Axiophot 135显微镜配备200W 汞灯， 冷 CCD照相系统捕捉彩色图像， BDS (Biological Detection System) 软件进行 处理。 2 . 多重标记探针同时与染色体片子杂交，采用单带通滤光片或多带通滤光 片依次观察。我们使用63X ， 1.2N.A. 物镜和滤光片系统来激发和观察德克萨 斯红或罗丹明、 FITC 或 Cy3、 CY5 荧光素。 CA3 和 D A 的染色体R 带型采用阿 的 平 （quinacrine) 滤光片系统观察。 3 . 检测染色体非整倍性或重排，应选择好的杂交区域中的2 0 个中期细胞进 行评估。该区域的细胞应具有高信噪比、分散比较好的中期分裂相。抓取代表性 图像，并将原始图片保存在专门的文件夹中，不应经过增强、修正或涂改。 4 . 注释 1 . 与 BAC等成熟的资源共同使用， FISH 技术成为定位人类基因和新的染 色体断裂点的最迅速准确的方法。另外，稳定的高分辨染色体带型有助于FISH 杂交确定染色体重排。根据有序列资料的BAC克 隆 ，研究者可以迅速将细胞遗 传学的结果与序列相联系，并进一步应用信息进行广泛的分子细胞遗传学分析。 2 . 我们举两个例子说明BAC资源库在分子细胞遗传学中的应用：肿瘤与生 殖有关非整倍体的检测。其他的应用包括2 1 号 染 色 体 的 分 析 癌 症 基 因 分 离 和 Williams综合征的基因组组织和构造「13]、染 色 体 非 整 倍 性 分 析 。 3 . 例 1 中 （图 2A) 将资源库中BAC克隆的探针与原发性甲状腺滤泡癌病 例的染色体进行F IS H 杂 交 ，进一步证实之 前 采 用 比 较 基 因 组 杂 交 （CGH) 发 现 的 2q2 1 的特异区域扩增， F IS H 对 于 将 C G H 观察到的低分辨的扩增与DNA 序列相联系是非常重要的。实验结果确定了一种候选基因PKCe，它可能在甲状 腺肿瘤发生中起作用[11’15]。在这项研究中BAC的应用证明：染色体区带特异性 BAC有助于识别未知的对肿瘤发生起作用的新基因，以及确定扩增区域的分子 结构。 4 . 例 2 染 色 体 非 整 倍 性 分 析 （图 2B) ， 采 用 与 染 色 体 21q22.1-22. 3 相关的 BAC探针与染色体8p23. 3 进 行 FISH 杂交，缩小与此出生缺陷有关的染色体断 裂点的范围。对比传统细胞遗传学的结果，我们发现伴随着D21S65-D21S5 5 的 缺失，存在端粒标记物D21S3 8 和 SlOOB的易位。临床结果显示唐氏综合征标记 物 D21S5 5 和 D21S6 5 的缺失，该区段到端粒的标记物二倍体。对 8p 而 言 ， 6 个 BAC确定其末稍带，只有最末端的缺失，这 说 明 8p 缺失对于孩子的出生缺陷表 型的贡献可能极小。断裂 点S T S 的确定也将候选基因与孩子缺陷性状相联系。

    5 . 为了得到稳定的FISH 结 果 ，应注意下述涉及从染色体制备到图像捕捉 每一步操作的要点，最重要的步骤之一是如何得到高质量的染色体标本，其他如 DNA变性、杂交探针检测条件与之相比显得无足轻重。我们将按实验顺序说明 各个应注意的要点。 6 . 中期染色体片子的质量和标本预处理对得到好的信号至关重要。高质量 的染色体片子应满足下述标准 ：① 中期染色体均勻分散，残 留的细胞质越少越 好 ；②几乎没有染色体重叠；③染色体形状清晰可辨。为得到这样的片子，应注 意调整下述条件：低渗处理时间和细胞固定、滴片和蒸汽熏片、烤片、染色体变 性 时 间 （新鲜制备的染色体处理需要较短的变性时间） 。 适当的调整实验条件才 能得到形态清晰的染色体，不 会 出 现 “毛边”现象。这样探针才能够更有效地结 合 靶 DNA，提高结合效率。 7 . 使用多家公司的试剂盒同样都能得到高质量的BAC DNA。步 骤 17〜21 (本 章 3. 2 ) 是提取高质量的DNA必需的步骤。 D N A 中不能含有可能抑制DNA 聚合酶活性的杂质，如金属、去污剂等。通常碱 性 裂 解DNA应经过苯酚/氯仿 抽提和异丙醇沉淀的处理。 8 . 许多标记方法都适用于定位BAC克 隆 的 FISH，包括缺口平移或随机引 物法，每种都有直接和间接标记试剂。比起随机引物法，缺口平移标记的探针可 以得到较髙的信噪比，但 使 用 的 D NA 量 要 多 1 0 倍 。用 于 直 接 标 记 的 试 剂 （如 荧光素标记的核苷酸）比用于间接标记的试剂（如生物素或地高辛）昂贵得多。 当使用BAC作为探针的时候，两种标记方法能得到同样清晰的信号。我们通常 采用缺口平移试剂盒标记，使用生物素-14-dA T P 或地高辛-11-dU T P 做间接标 记 ， fluorolinkCy5-dCTP 和 fluorolinkCy3-dCTP 用做直接标记。除 DNA 酶浓 度和孵育时间外，完全按照试剂盒提供的操作步骤进行实验。标 记 后 的 D NA 片 段的大小很重要，应在1〇〇 〜5〇〇 bp，片段长度等于或大于IOOObp时 ，将产生髙 背景，弱信号，导致实验失败。 9 . 封闭和检测步骤也很重要，应注意正确的顺序和试剂。整个信号检测过 程 中 ，每一步都要很小心；片子绝不能干燥，即使只是部分的片子干燥就会影响 结果。尽管甩掉片子上的液体避免稀释抗体或下一步的试剂也很重要，但是应尽 可能的迅速进行操作。一旦片子干燥，背景将会很高、信噪比将大大降低。 抗体应小量分装后保存在一20°C 。保存超过一年的抗体使用时浓度应加倍， 如果产生高背景，可以使用Sephadex 0 5 0 柱纯化抗体，这样可以恢复正常的信 噪比；如果信号太弱，换用新的抗体。 10. 如我们之前在方法[8]中所述，采用最老的片子，几 个 月 到 几 年 （<1〇 年）同样可以得到最好的染色体带型。但是老片子不能得到明亮的F IS H 信号。 因此，为了同时得到清晰的带型和明亮的信号，新制备的片子应在50〜55°C烤 4h (烤 15h不会影响信号） 。 室 温 （20〜25°C )老化片子2〜 4 周后，将片子保存
    在一70°C备用。 CA3 染色新鲜的片子时，应将染色时间延长到I .5h ，老片子的 染色时间可相应的缩短到30min。抗淬灭剂对于防止信号猝灭很重要，但是使用 时只需要薄薄的一层即可。 11.选择进行图像捕捉和处理的中期应满足下述标准：①同源杂交信号明 亮 ；②背景低；③染色体重叠少或没有重叠；④染色体细长但结构致密。绝大多 数的荧光素淬灭迅速，包括色霉素得到的R 带 ，因此，片子暴露在激发光源下 的时间尽可能得短。为确定一个BAC DNA，应 计 数 至 少 10〜2 0 个细 胞 ，保存 至少两张图片进行分析。如果需要，应适当提高信号强度以识别额外的杂交信 号 ，因为有些信号可能因较低的信号强度而没有被观察到。.如 果 BAC用于细胞 遗传学分析，应发展出一个质量控制标准，这对实验的成功至关重要。

    来源：丁香实验

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