IMPACT™-TWIN 蛋白纯化系统，可以不用任何蛋白酶，表达N-Cys的蛋白，一步过柱纯化。
丁香园论坛
3404
IMPACT™-TWIN 蛋白纯化系统
(蛋白单柱亲和纯化、标记及连接)
E6950S pdf下载
概述:
NEB在世界上最早开展内含肽（intein）技术的开发(1)。IMPACTTM 系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，能应用到蛋白质工程的许多重要领域(1-11)。IMPACTTM 表达的目的蛋白与蛋白自剪接元件（称为"内含肽"，intein）及几丁质结合蛋白形成融合蛋白, 通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。然后诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。
将目的蛋白连接到pTWIN载体intein2的N端，还原剂(DTT)可诱导内含肽N端肽键裂解，将目标蛋白释放出来 (图1)。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image004.gif
将目的蛋白连接到pTWIN载体intein1的C端，温度/PH的改变即可诱导内含肽C端肽键裂解(图2) (7)。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image006.gif
与其它利用融合蛋白纯化的方法比较，IMPACTTM 系统不需用蛋白酶。因此，这是一种快速而经济的蛋白纯化方法。
该系统还有数种其它用途，产生的目的蛋白可带有N末端的半胱氨酸和/或C末端的硫酯键，进行蛋白的标记、连接和环化(图3)（7-10）。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image008.gif
采用MESNA (2-mercaptoethanesulfonic acid) 诱导内含肽裂解，目的蛋白C端带有活化的巯脂基团，可与N端为半胱氨酸的多肽高效连接 (8, 9)。通过蛋白连接反应，可将非编码的氨基酸片段或标记物连接至已表达及纯化的蛋白序列上。
图1: 利用巯基化合物诱导Intein2裂解进行蛋白纯化: 采用pTWIN载体系统表达蛋白，目的蛋白C末端与内含肽Intein2形成融合，通过DTT(1,4-dithiothreitol)诱导的内含肽裂解作用可将目的蛋白分离释放。采用MESNA(2-mercaptoethanesulfonic acid)诱导内含肽裂解，目的蛋白C端带有活化的巯脂基因，可与N端为半胱氨酸的多肽高效连接。
图2: 利用pH值和温度改变来诱导Intein1裂解进行蛋白纯化: 采用pTWIN载体系统表达蛋白，目的蛋白N末端与内含肽形成融合，通过融合蛋白中的几丁质结合蛋白(CBD)进行几丁质柱层析，进而通过pH值(pH6-7)和温度改变诱导内含肽裂解，切割内含肽与目的蛋白之间的肽键，将目的蛋白分离释放，而几丁质结合蛋白与内含肽仍结合在几丁质介质上。
图3：蛋白的环化：用pTWIN载体表达两端融合有Intein1和Intein2的目的蛋白，经裂解释放后产生N端的半胱氨酸残基和C端的硫酯键。 当蛋白构象导致其N端与C端接近情况下，能进行自我连接反应，从而形成通过肽键连接的环状蛋白质。
什么是内含肽（intein）？
一段随功能蛋白一起表达，并在表达后可进行自剪接的多肽，它兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子（RNA水平自剪切）的作用方式类似。
本系统的优势:
单柱一步纯化蛋白。
无需蛋白酶作用即可将目的蛋白与融合蛋白(内含肽与几丁质结合蛋白)分离。
可介导蛋白质的体外连接、标记和环化。
应用IPTG诱导的T7启动子可使蛋白高水平表达并可对其进行有效调控，有助表达有细胞毒性的蛋白。
IMPACT-TWIN系统包含成分:
三种pTWIN E.coli表达载体：pTWIN1, pTWIN2, pTWIN-MBP1
几丁质珠：与表达的融合蛋白具有亲和性，用于蛋白纯化。（结合容量=2 mg/ml）
E.coli菌株 ER2566
兔抗CBD（Chitin Binding Domain）血清
三种测序引物，分别为：Ssp DnaB Intein Forward, Mxe Intein Reverse 和 Mth RIR1 Intein Reverse Sequencing Primers
DTT 和 SDS-PAGE上样缓冲液
使用说明书
参考文献:
1. Chong, S. et al. (1997) Gene 192, 277-281.
2. Chong, S. et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26, 5109-5115.
3. Chong, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10567-77.
4. Chong, S. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 22159-22168.
5. Watanabe, T. et al. (1994) J. Bacteriol. 176, 4465- 4472.
6. Dubendorff, J. W. and Studier, F. W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 45-59.
7. Mathys, S. et al. (1999) Gene 231, 1-13.
8. Evans, T. C. et al. (1998) Protein Sci. 7, 2256- 2264.
9. Evans, T. C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 3923- 3926.
10. Evans, T. C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 18359-18363.
11. Southworth, M. et al. (1999) Biotechniques 27, 110- 120
(蛋白单柱亲和纯化、标记及连接)
E6950S pdf下载
概述:
NEB在世界上最早开展内含肽（intein）技术的开发(1)。IMPACTTM 系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统，能应用到蛋白质工程的许多重要领域(1-11)。IMPACTTM 表达的目的蛋白与蛋白自剪接元件（称为"内含肽"，intein）及几丁质结合蛋白形成融合蛋白, 通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。然后诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。
将目的蛋白连接到pTWIN载体intein2的N端，还原剂(DTT)可诱导内含肽N端肽键裂解，将目标蛋白释放出来 (图1)。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image004.gif
将目的蛋白连接到pTWIN载体intein1的C端，温度/PH的改变即可诱导内含肽C端肽键裂解(图2) (7)。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image006.gif
与其它利用融合蛋白纯化的方法比较，IMPACTTM 系统不需用蛋白酶。因此，这是一种快速而经济的蛋白纯化方法。
该系统还有数种其它用途，产生的目的蛋白可带有N末端的半胱氨酸和/或C末端的硫酯键，进行蛋白的标记、连接和环化(图3)（7-10）。
http://www.biofriendship.com.cn/jiesjuefangan/imagies/IMPACT_2image008.gif
采用MESNA (2-mercaptoethanesulfonic acid) 诱导内含肽裂解，目的蛋白C端带有活化的巯脂基团，可与N端为半胱氨酸的多肽高效连接 (8, 9)。通过蛋白连接反应，可将非编码的氨基酸片段或标记物连接至已表达及纯化的蛋白序列上。
图1: 利用巯基化合物诱导Intein2裂解进行蛋白纯化: 采用pTWIN载体系统表达蛋白，目的蛋白C末端与内含肽Intein2形成融合，通过DTT(1,4-dithiothreitol)诱导的内含肽裂解作用可将目的蛋白分离释放。采用MESNA(2-mercaptoethanesulfonic acid)诱导内含肽裂解，目的蛋白C端带有活化的巯脂基因，可与N端为半胱氨酸的多肽高效连接。
图2: 利用pH值和温度改变来诱导Intein1裂解进行蛋白纯化: 采用pTWIN载体系统表达蛋白，目的蛋白N末端与内含肽形成融合，通过融合蛋白中的几丁质结合蛋白(CBD)进行几丁质柱层析，进而通过pH值(pH6-7)和温度改变诱导内含肽裂解，切割内含肽与目的蛋白之间的肽键，将目的蛋白分离释放，而几丁质结合蛋白与内含肽仍结合在几丁质介质上。
图3：蛋白的环化：用pTWIN载体表达两端融合有Intein1和Intein2的目的蛋白，经裂解释放后产生N端的半胱氨酸残基和C端的硫酯键。 当蛋白构象导致其N端与C端接近情况下，能进行自我连接反应，从而形成通过肽键连接的环状蛋白质。
什么是内含肽（intein）？
一段随功能蛋白一起表达，并在表达后可进行自剪接的多肽，它兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子（RNA水平自剪切）的作用方式类似。
本系统的优势:
单柱一步纯化蛋白。
无需蛋白酶作用即可将目的蛋白与融合蛋白(内含肽与几丁质结合蛋白)分离。
可介导蛋白质的体外连接、标记和环化。
应用IPTG诱导的T7启动子可使蛋白高水平表达并可对其进行有效调控，有助表达有细胞毒性的蛋白。
IMPACT-TWIN系统包含成分:
三种pTWIN E.coli表达载体：pTWIN1, pTWIN2, pTWIN-MBP1
几丁质珠：与表达的融合蛋白具有亲和性，用于蛋白纯化。（结合容量=2 mg/ml）
E.coli菌株 ER2566
兔抗CBD（Chitin Binding Domain）血清
三种测序引物，分别为：Ssp DnaB Intein Forward, Mxe Intein Reverse 和 Mth RIR1 Intein Reverse Sequencing Primers
DTT 和 SDS-PAGE上样缓冲液
使用说明书
参考文献:
1. Chong, S. et al. (1997) Gene 192, 277-281.
2. Chong, S. et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26, 5109-5115.
3. Chong, S. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10567-77.
4. Chong, S. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 22159-22168.
5. Watanabe, T. et al. (1994) J. Bacteriol. 176, 4465- 4472.
6. Dubendorff, J. W. and Studier, F. W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 45-59.
7. Mathys, S. et al. (1999) Gene 231, 1-13.
8. Evans, T. C. et al. (1998) Protein Sci. 7, 2256- 2264.
9. Evans, T. C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 3923- 3926.
10. Evans, T. C. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 18359-18363.
11. Southworth, M. et al. (1999) Biotechniques 27, 110- 120
