【原创】iTRAQ技术问题答疑

丁香园2015-06-29

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1. itraq的原理是什么？

Itraq的检测可以做这样的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的铺在了一个有384个孔的平板上，然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对，所以，如果假设每个一个样本中有100个蛋白，他们的浓度均为1%，那么得到的结果就是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，可以达到90以上；如果一个样本中有100个蛋白，有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。

2.iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术，具有如下优势：

2.1灵敏度很高，检测限较低，可检测出低丰度蛋白；

2.2高通量：同时对4-8个样本进行分析，提高实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析；

2.3分离能力强，分析范围广，iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行分离鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白；

2.3结果可靠：通过高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，即可获得相对定性与定量分析结果；

2.5自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

由此可得，iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白，但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面，二维电泳技术有一定长处，对iTRAQ的实验结果有互补作用。

3. LC/MS中蛋白处理是定量还是定性？

这是属于定量，需在蛋白定量后，各取相同量（50-100ug）的蛋白（体积不大于25ul，少于25ul的用专用裂解液补至25ul）进行还原化和烷基化。

4. LC/MS对需要检测的蛋白有量的要求吗？

有的，要求蛋白量最低50ug，浓度最低要为5ug/uL，否则同位素无法标记。

5. 数据分析中主要看哪些参数？

对于液质联用的数据分析，一般观察的参数为：TotalIon Score C.I. %（可信度）和Tag-80/Tag-0（两样本的比值）。

6. 众多可信度数值中，主要选择哪些进行研究？

一般来说可信度在80%以上的均为可信程度非常高的。有些蛋白可信度在60%以上的也可以作为参考数据。

7. 可信程度低于80%的数据有意义吗？

可信程度低于此值的，如果有感兴趣的蛋白可以通过ELISA、WB、Q-PCR、液态芯片等技术手段进一步验证，毕竟LC/MS是研究蛋白组学的方法之一，如全面研究还是要综合各种研究方法。

8. 两样本的比值都代表什么？

两样本的比值如果在0.9-1.1之间的，可以认为两样本的含量是一样的，即比值为1：1；而小于0.9或大于1.1均可认为两样本之间的比值是有差异的。

9. 质谱图中显示的是各种蛋白吗？

不是各种蛋白而是蛋白被打碎后的离子图谱，由于质谱法是电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出的是离子的准确质量，由此来确定离子的化合物组成。

10. 液质联用是不是可以检测所有蛋白？

原则上讲是这样的，如果单个蛋白在所提供的样本中的含量少于100ng可能就检测不出来了，总体上样量为50-100ug，一般每次可以检测出来的蛋白数量从几百到几千都有可能，取决于标本本身的情况。

11.提供的结果除了分析数据外，是不是包括蛋白名称还是蛋白的大致归类？

给出的是蛋白的名称，按照可信度从大到小排列。

12.是否还有每个蛋白的鉴定图谱或者提供蛋白结果分析?

没有每个蛋白的鉴定图谱，图谱是肽段。

13. 蛋白上样量是多少？收集蛋白体积100ul吗？应该大于100ul还是小于100ul？

itraq对蛋白收集体积没有特别要求，只要求浓度至少是5ug/ul的蛋白至少20ul即可。

14.差异蛋白试验的结果包括哪些呢？存在差异的蛋白种类，名称，肽段序列，分子量，pI或者有否其他的什么信息，结果是以什么形式进行报考呢？表格或图片？

差异蛋白试验的结果包括：ProteinName、Species、AccessionNumber、ProteinMW、ProteinPI、TotalIon Score、L/N；结果以表格形式提供。

15.对实验的样品有什么要求？浓度，纯度，是否可以有盐，如果是胞内蛋白需要怎样裂解，或者你们是否可以帮忙处理样品？

若蛋白由您提供给我们，则蛋白浓度要求5ug/ul，体积要求至少50ul，总蛋白量至少100ug；或者您直接提供组织、细胞或菌体给我们，蛋白由我们来抽提，但是您要告知我们蛋白是抽提全蛋白还是膜蛋白还是其他特殊蛋白。

16.检测的蛋白是酶，酶分型较多，是否可将每种酶分型都检测出来？

检测itraq有一个蛋白库，这个库是网上最新公布的世界上研究出来的所有蛋白信息，如果您检测的酶的各种分型此库里都有收录，那么就可以检测出来，如果没有就检测不出来，这个要看世界上对该种酶研究的程度。

17.是否可以提供蛋白序列？ 

由于检测出的蛋白数量很多，都是成百上千个，itraq机器不可能将检测出的每种蛋白序列都提供给您，这个工作量非常大，而且也不是每一个检测出来的蛋白对您都有意义，一般可以先提供结果，您选择研究有意义的蛋白名称，我们可以提供相应蛋白肽段给您。

18. 若使用itaq检测human血清，需要血清量是多少？

若itraq方法检测血清，则检测前需要对血清进行高峰度蛋白去除，收集低丰度蛋白后进行itraq检测，去除高峰度蛋白方法是使用相应提纯柱子，此柱子很昂贵。

19. Itraq检测是否需要重复以便使结果具有统计学意义?

不需要，Itraq技术本身的算法，可以认为得到的蛋白之间的比例，并且是可信度高的实验结果是具有统计学意义的，并且在这个基础上可以进行后续的验证。

20. 目前开展该项业务的公司有很多，能否推荐下哪家公司做的比较好？

目前能开展itraq的公司挺多的，个人推荐上海舜百生物做的相对还是不错的。之前是叫舜田，现在据说服务质量挺好，周期大约1个月左右。

21. 如果打算开展该项试验，需要提供什么样的样品形式？

最好是提供抽提好的蛋白，冻成干粉，然后用干冰快递过来。组织蛋白抽提不能用含二维电泳的变性剂来裂解蛋白。如果组织的话，存放到-80度冰箱中，然后用干冰快递过来，上海本地的，也可以将组织用冻存管装好，投入液氮中运过来即可。