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丁香园论坛
1604
RNA沉默机制研究进展
RNA沉默机制的研究主要集中在遗传和生化方面。遗传方面，各研究小组选择遗传突变子的筛选策略，即筛选RNA干涉功能丧失的突变基因。目前在拟南芥中已发现了SGS1、SGS2、SGS3以及SDE1、SDE2、SDE3和SDE4等多个参与RNA干涉作用的基因，（Elmayan,1998;Dalmay,2000）而在链孢霉中发现产生基因消除所必需的基因QDE1、QDE2和QDE3（Tijsterman,2002）基因序列分析发现，不同生物中RNA干涉相关的必需基因互为同源基因。生化方面，Hamilton 等人率先在发生PTGS的西红柿中检测到了与被沉默基因同源的、大小约为25nt的小片段RNA分子，而未发生PTGS的西红柿却没有检测到这种小分子。（Hamilton，1999）。Zamore等在果蝇RNA干涉实验中观察到，双链RNA首先被降解成21~23nt的小片段，然后相应的mRNA也在与双链RNA同源的区段内，按照同样的间隔被降解成21~23nt的小片段（Zamore，2000）。
RNAi作用分子
目前对于RNA干涉中起作用的RNA小分子已有了比较透彻的研究，这些小分子目前被分为以下几类：一种是小干涉RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）；另一种是微RNA分子（MicroRNAs，miRNAs）；这是两种最主要的作用小分子；最近又有两类参与RNA干涉作用的小分子被发现，分别是微小非编码RNA（Tiny non-coding RNAs,tncRNAs）和小调控RNA分子（Small modulatory RNA,smRNAs）(Victor Ambros,2003; Kuwabara,2004)。tncRNAs是线虫基因组中编码的一类约在20-22nt的RNA分子，它们在进化上并不保守，功能上可能与发育调控有关，具体功能目前还未有报道(Victor Ambros,2003)。smRNAs是2004年初报道的在老鼠中发现的一种RNA小分子，只在成熟神经细胞中调控神经细胞特异基因表达。（Kuwabara,2004)
siRNAs小分子 和miRNAs小分子是RNA干涉作用中两种主要的小分子。两者既有不同点，又有许多相似之处。siRNAs是由于Dicer酶类酶切长的双链RNA前体产生的，前体来源于病毒复制本、细胞RNA-依赖的RNA聚合酶(cellular RNA-dependent RNA polymerases,RDRPs)作用的结果或者是基因组内反向重复片段转录的结果,5’端带磷酸基团、3’端带羟基、大小约为21-25nt的RNA分子；miRNAs分子在存在形式上基本与siRNAs分子相同，大小约为19-25nt的RNA分子；但其与siRNAs的关键不同点在于它的来源，它是Dicer酶类加工RNA聚合酶II从内源非编码蛋白基因转录产生的高度结构化的RNA前体分子而成。但两者均依赖于RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complexes,RISC）中的Argonaute蛋白的活性进行（He，2004）。两者的区别：
1） siRNAs以双链形式存在，而成熟的miRNAs是以单链形式存在的；
2） miRNAs参与正常情况下的生长发育基因调控，在大多数的多细胞生物基因组中都有编码，它们沉默蛋白合成阶段的基因，而siRNAs不参与生物体的正常生长，只有在病毒或其它双链RNA诱导的情况下才产生，它们通过与互补序列的精确配对而促进mRNA的切割或招募抑制蛋白、或直接指导DNA的修饰而起作用；
3） Dicer酶对两类RNA分子的加工过程不同；多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha 和Dicer RNase III在细胞核及细胞质分两步分别发生的；而siRNAs则是仅由Dicer酶类作用，而且是在细胞质中加工完成的。
4） miRNAs在多细胞动物界或在有关的植物品种中是保守的，而siRNAs序列是完全多样的，在作用方式上，miRNAs并不需要与它们的靶目标完全匹配，而siRNAs则需要与它们的靶目标完美匹配。（（Dmitry ,2004；Michael,2005）
所有的证据均支持两种小分子是以双链生成的，但在功能复合体中以单链形式集累，最有说服力的证据表明miRNAs分子最初含有两条链的证据是miRNAs的生物合成在植物及多细胞动物中均可被病毒蛋白p19所阻断，而p19蛋白结合双链的RNA小分子结构但并不结合单链的RNA小分子（（Ye，2003；Lakatos，2004），那么p19蛋白抑制miRNAs功能的最简单解释就是miRNAs分子最初是以双链形式短暂存在的。
RNAi效应复合体的组装
RISC组装的关键步骤是将siRNAs和miRNAs小分子两条链中的一条选择进入该复合体，目前RISC复合体的体外研究只在Drosohaila得到研究。（Lee，2004）
果蝇中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶类进行加工的，Dcr-1酶产生miRNAs小分子而 Dcr-2酶产生siRNAs小分子，Dcr-2酶还指导siRNAs小分子的一条链进入RISC复合体。人类中的Dicer酶也可能有指导siRNAs小分子进入RISC复合体的功能，因为Dicer酶缺失的人类细胞中siRNAs小分子并不能诱导产生RNA沉默。（Doi，2003）不同的是，siRNAs小分子可以在Dicer酶敲除的ES 细胞中行使降低靶基因表达的功能。（Kanellopoulou,2005）
目前提出两条类似的Drosohaila RISC组装步骤（Pham,2004;Tomari,2004），而Tomari,2005将两条类似途径整合，如图1-1。
Tomari,2004a提出，RISC的组装开始于双链siRNAs小分子整合到未确定的蛋白形成复合体B，在体外，复合体B是RISC装载复合体（RISC-loading complex,RLC;formerly “complex A”）的动力学前体，尽管复合体B作为RISC组装的早期中间体的途径还不是很完整，但RLC在将siRNAs小分子装载到RISC中的关键作用已得到有力支持 (Tomari,2004b) 。 RLC含有Dcr-2蛋白和它的合作者R2D2蛋白,而后者具有前后相近的dsRNA结合结构域，而这两个蛋白质对于体内的RNA沉默中的RLC的形成及siRNAs小分子解链都是必需的。（Liu，2003）RLC既含有双链的siRNAs小分子，也含有小量的单链siRNAs小分子，这说明双链siRNAs小分子的解链始于这个复合体。RLC中的siRNAs小分子通过Dcr-2蛋白和RICS前体（holo-RISC）的Ago蛋白的相互作用而将RICS前体征募过来形成RISC复合体。Pham,2004提出的途径与此类似。
RISC功能
小RNA分子进入RISC复合体后，小RNA分子至少有三种不同的沉默方式。在RNAi途径中，小RNA分子介导RISC切割靶RNA，RISC的切割需要Mg2+存在，但此反应可被硫代磷酸酯在易断裂的磷酸基团处抑制，切割产物具有5’端磷酸基团、3’端羟基。该反应被认为是通过Argonaute蛋白的亚家族的Piwi结构域催化的，该结构域是Mg2+依赖的RNase H的结构同系物，而RNase H切割RNA-DNA杂合体中的RNA链（Song，2003；2004）。不同于RNase H，每一个具有切割能力的RISC只在其靶RNA目标的唯一磷酸二酯键处进行断裂（即易断裂的磷酸基团处）（Elbashir，2001）。RISC是一种多转换酶类（multiple turnover enzyme），Argonaute蛋白质是RISC中的核心组分。小RNA分子将RISC引导到靶RNA分子，靶目标被切割后，小RNA分子完封不动地离开RISC（Martinez and Tuschl,2004）。
目前研究表明将RISC绑定到靶RNA分子上的能量来源于小RNA分子5'端（Haley,2004; Doench,2004），这是siRNAs小分子和miRNAs小分子与反义寡核苷酸的本质不同之处，后者所有的碱基对特异性具有相等的贡献。倘若多个小RNA分子结合到靶目标上，siRNAs小分子和miRNAs小分子的3'端与靶RNA分子的完全配对对于翻译抑制及靶mRNA破坏并不是必需的，从技术角度说，绝大多数小RNA分子不但下调它们的目标靶mRNA分子，而且减少其它与小RNA分子有部分互补序列的mRNA分子的表达。(Jackson,2003)
在翻译抑抑制途径，小RNA分子介导RISC结合到mRNA分子并抑制其翻译成蛋白质而不是切割mRNA分子。多细胞动物中的miRNAs小分子主要是，当然并不总是，介导翻译抑制而不是切割它们。相对而言，大多数植物miRNAs小分子直接指导靶mRNA分子的切割。在很多详细研究的多细胞动物翻译抑制例子中，翻译抑制是靶mRNA分子的3'端非翻译区位点对小RNA分子指导的RISC结合的反应。实际上，mRNA分子3'端非翻译区的多个候选结合位点可以作为预测mRNA分子是否受小RNA分子调控的指示标记。（Lewis，2003）
小RNA分子还可以指导抑制性异染色质的形成。到目前为止，对这条途径相关的唯一复合体的描述是关于Schizosaccharomyces pombe 的RITS（ a RISC –like complex that contains siRNA），关于RITS如何指导组蛋白的修饰从而促进抑制性异染色质的形成的机制还不清楚。小RNA分子通过DNA甲基化而抑制翻译目前在多细胞动物中也有报道。（Kawasaki，2004）
RNA沉默机制的研究主要集中在遗传和生化方面。遗传方面，各研究小组选择遗传突变子的筛选策略，即筛选RNA干涉功能丧失的突变基因。目前在拟南芥中已发现了SGS1、SGS2、SGS3以及SDE1、SDE2、SDE3和SDE4等多个参与RNA干涉作用的基因，（Elmayan,1998;Dalmay,2000）而在链孢霉中发现产生基因消除所必需的基因QDE1、QDE2和QDE3（Tijsterman,2002）基因序列分析发现，不同生物中RNA干涉相关的必需基因互为同源基因。生化方面，Hamilton 等人率先在发生PTGS的西红柿中检测到了与被沉默基因同源的、大小约为25nt的小片段RNA分子，而未发生PTGS的西红柿却没有检测到这种小分子。（Hamilton，1999）。Zamore等在果蝇RNA干涉实验中观察到，双链RNA首先被降解成21~23nt的小片段，然后相应的mRNA也在与双链RNA同源的区段内，按照同样的间隔被降解成21~23nt的小片段（Zamore，2000）。
RNAi作用分子
目前对于RNA干涉中起作用的RNA小分子已有了比较透彻的研究，这些小分子目前被分为以下几类：一种是小干涉RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）；另一种是微RNA分子（MicroRNAs，miRNAs）；这是两种最主要的作用小分子；最近又有两类参与RNA干涉作用的小分子被发现，分别是微小非编码RNA（Tiny non-coding RNAs,tncRNAs）和小调控RNA分子（Small modulatory RNA,smRNAs）(Victor Ambros,2003; Kuwabara,2004)。tncRNAs是线虫基因组中编码的一类约在20-22nt的RNA分子，它们在进化上并不保守，功能上可能与发育调控有关，具体功能目前还未有报道(Victor Ambros,2003)。smRNAs是2004年初报道的在老鼠中发现的一种RNA小分子，只在成熟神经细胞中调控神经细胞特异基因表达。（Kuwabara,2004)
siRNAs小分子 和miRNAs小分子是RNA干涉作用中两种主要的小分子。两者既有不同点，又有许多相似之处。siRNAs是由于Dicer酶类酶切长的双链RNA前体产生的，前体来源于病毒复制本、细胞RNA-依赖的RNA聚合酶(cellular RNA-dependent RNA polymerases,RDRPs)作用的结果或者是基因组内反向重复片段转录的结果,5’端带磷酸基团、3’端带羟基、大小约为21-25nt的RNA分子；miRNAs分子在存在形式上基本与siRNAs分子相同，大小约为19-25nt的RNA分子；但其与siRNAs的关键不同点在于它的来源，它是Dicer酶类加工RNA聚合酶II从内源非编码蛋白基因转录产生的高度结构化的RNA前体分子而成。但两者均依赖于RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complexes,RISC）中的Argonaute蛋白的活性进行（He，2004）。两者的区别：
1） siRNAs以双链形式存在，而成熟的miRNAs是以单链形式存在的；
2） miRNAs参与正常情况下的生长发育基因调控，在大多数的多细胞生物基因组中都有编码，它们沉默蛋白合成阶段的基因，而siRNAs不参与生物体的正常生长，只有在病毒或其它双链RNA诱导的情况下才产生，它们通过与互补序列的精确配对而促进mRNA的切割或招募抑制蛋白、或直接指导DNA的修饰而起作用；
3） Dicer酶对两类RNA分子的加工过程不同；多细胞动物的miRNAs分子是通过Drosha 和Dicer RNase III在细胞核及细胞质分两步分别发生的；而siRNAs则是仅由Dicer酶类作用，而且是在细胞质中加工完成的。
4） miRNAs在多细胞动物界或在有关的植物品种中是保守的，而siRNAs序列是完全多样的，在作用方式上，miRNAs并不需要与它们的靶目标完全匹配，而siRNAs则需要与它们的靶目标完美匹配。（（Dmitry ,2004；Michael,2005）
所有的证据均支持两种小分子是以双链生成的，但在功能复合体中以单链形式集累，最有说服力的证据表明miRNAs分子最初含有两条链的证据是miRNAs的生物合成在植物及多细胞动物中均可被病毒蛋白p19所阻断，而p19蛋白结合双链的RNA小分子结构但并不结合单链的RNA小分子（（Ye，2003；Lakatos，2004），那么p19蛋白抑制miRNAs功能的最简单解释就是miRNAs分子最初是以双链形式短暂存在的。
RNAi效应复合体的组装
RISC组装的关键步骤是将siRNAs和miRNAs小分子两条链中的一条选择进入该复合体，目前RISC复合体的体外研究只在Drosohaila得到研究。（Lee，2004）
果蝇中，siRNAs和miRNAs小分子是由不同的Dicer酶类进行加工的，Dcr-1酶产生miRNAs小分子而 Dcr-2酶产生siRNAs小分子，Dcr-2酶还指导siRNAs小分子的一条链进入RISC复合体。人类中的Dicer酶也可能有指导siRNAs小分子进入RISC复合体的功能，因为Dicer酶缺失的人类细胞中siRNAs小分子并不能诱导产生RNA沉默。（Doi，2003）不同的是，siRNAs小分子可以在Dicer酶敲除的ES 细胞中行使降低靶基因表达的功能。（Kanellopoulou,2005）
目前提出两条类似的Drosohaila RISC组装步骤（Pham,2004;Tomari,2004），而Tomari,2005将两条类似途径整合，如图1-1。
Tomari,2004a提出，RISC的组装开始于双链siRNAs小分子整合到未确定的蛋白形成复合体B，在体外，复合体B是RISC装载复合体（RISC-loading complex,RLC;formerly “complex A”）的动力学前体，尽管复合体B作为RISC组装的早期中间体的途径还不是很完整，但RLC在将siRNAs小分子装载到RISC中的关键作用已得到有力支持 (Tomari,2004b) 。 RLC含有Dcr-2蛋白和它的合作者R2D2蛋白,而后者具有前后相近的dsRNA结合结构域，而这两个蛋白质对于体内的RNA沉默中的RLC的形成及siRNAs小分子解链都是必需的。（Liu，2003）RLC既含有双链的siRNAs小分子，也含有小量的单链siRNAs小分子，这说明双链siRNAs小分子的解链始于这个复合体。RLC中的siRNAs小分子通过Dcr-2蛋白和RICS前体（holo-RISC）的Ago蛋白的相互作用而将RICS前体征募过来形成RISC复合体。Pham,2004提出的途径与此类似。
RISC功能
小RNA分子进入RISC复合体后，小RNA分子至少有三种不同的沉默方式。在RNAi途径中，小RNA分子介导RISC切割靶RNA，RISC的切割需要Mg2+存在，但此反应可被硫代磷酸酯在易断裂的磷酸基团处抑制，切割产物具有5’端磷酸基团、3’端羟基。该反应被认为是通过Argonaute蛋白的亚家族的Piwi结构域催化的，该结构域是Mg2+依赖的RNase H的结构同系物，而RNase H切割RNA-DNA杂合体中的RNA链（Song，2003；2004）。不同于RNase H，每一个具有切割能力的RISC只在其靶RNA目标的唯一磷酸二酯键处进行断裂（即易断裂的磷酸基团处）（Elbashir，2001）。RISC是一种多转换酶类（multiple turnover enzyme），Argonaute蛋白质是RISC中的核心组分。小RNA分子将RISC引导到靶RNA分子，靶目标被切割后，小RNA分子完封不动地离开RISC（Martinez and Tuschl,2004）。
目前研究表明将RISC绑定到靶RNA分子上的能量来源于小RNA分子5'端（Haley,2004; Doench,2004），这是siRNAs小分子和miRNAs小分子与反义寡核苷酸的本质不同之处，后者所有的碱基对特异性具有相等的贡献。倘若多个小RNA分子结合到靶目标上，siRNAs小分子和miRNAs小分子的3'端与靶RNA分子的完全配对对于翻译抑制及靶mRNA破坏并不是必需的，从技术角度说，绝大多数小RNA分子不但下调它们的目标靶mRNA分子，而且减少其它与小RNA分子有部分互补序列的mRNA分子的表达。(Jackson,2003)
在翻译抑抑制途径，小RNA分子介导RISC结合到mRNA分子并抑制其翻译成蛋白质而不是切割mRNA分子。多细胞动物中的miRNAs小分子主要是，当然并不总是，介导翻译抑制而不是切割它们。相对而言，大多数植物miRNAs小分子直接指导靶mRNA分子的切割。在很多详细研究的多细胞动物翻译抑制例子中，翻译抑制是靶mRNA分子的3'端非翻译区位点对小RNA分子指导的RISC结合的反应。实际上，mRNA分子3'端非翻译区的多个候选结合位点可以作为预测mRNA分子是否受小RNA分子调控的指示标记。（Lewis，2003）
小RNA分子还可以指导抑制性异染色质的形成。到目前为止，对这条途径相关的唯一复合体的描述是关于Schizosaccharomyces pombe 的RITS（ a RISC –like complex that contains siRNA），关于RITS如何指导组蛋白的修饰从而促进抑制性异染色质的形成的机制还不清楚。小RNA分子通过DNA甲基化而抑制翻译目前在多细胞动物中也有报道。（Kawasaki，2004）
