【交流】请教lentivirus shRNA技术问题

最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有几个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug PLKO.1 shRNA plasmid
10.5 ug pLP1
10.5 ug pLP2
9.0 ug pVSVG.
Then add in this order:
293.3 ul of TE buffer (0.1×, pH 8.8)
155.6 ul d.d.water
50.2 ul CaCl2 (2.5M)
Briefly mix, then add 500 ul 2×HBSS, dropwise under agitation by vortexing
at least 1~2min.Wait at least 5min(no more than 30min) at RT.

我看到别的常用的protocol，都是加齐各种质粒后直接用双蒸水补齐到500ul，然后再
加等体积的HBSS，最后加一定量的CaCl2。不知道我们这个protocol里加0.1×, pH 8.8
的TE用意何在？

2）配制转染复合物的时候，我们是一边蜗旋震荡一边滴加HBSS，但是我也注意到有些版本
的protocol却强调要gently mix，忌剧烈震荡，大家是怎么做的？

3）在转染后36和60小时收集病毒上清，3000 × g for 15 minutes at 4℃ to remove
cells and cell debris. 然后用PEG-it Virus Precipitation Solution在4度沉淀至
少12小时，1500 × g for 30 minutes at 4?C离心后用PBS重悬病毒颗粒，分装保存与-70度。
每次用浓缩后的病毒感染肝癌细胞后，都能在medium里面看到很多黑色的小点点（师姐包装的
病毒也有，但没这么明显），又不是污染，不同的细胞株里这个小黑点的多寡不一，有的很多很
多。很纳闷这个黑点到底来源于什么？磷酸钙沉淀？239FT细胞碎片？KD效率低是不是
因为这些小黑点的原因？

切盼高手指教，更期望分享各种成功的技巧和经验。
不甚感谢