【建议】本月讨论与整理专帖-T-A克隆，另开帖不加分！
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本月旧帖整理活动专题: T-A克隆技术
大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论
(1)如何筛选合适的宿主菌株
◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。
◇ 如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。
◇ 要表达重组蛋白，可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21（DE3）。
◇ 使用pGEM载体克隆大片段时（>7-8 kb），经转化的菌株在30oC而不是在37oC生长，更有利于连接。作简单的亚克隆连接实验，亚克隆转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要，更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会，应用尽可能高转化效率的感受态细胞（>108克隆/μg DNA）。
(2)大肠杆菌基因型
hsdR 有利于非甲基化DNA（如PCR扩增产物）的有效转化。
mcrA 有利于甲基化DNA（如基因组）的有效转化。
acZΔM15 用于蓝白斑筛选。
endA1 无Endonuclease I 酶活性，有利于质粒的纯化。
recA1 减少克隆DNA的非特异性重组。
DE3 编码T7 RNA聚合酶，用于诱导T7-启动的表达系统的表达。
DeoR 可以高效吸收大片段DNA，有利于文库的构建。
Tn10 含 有四环素抗性的转座子。
OmpT 表明大肠杆菌缺乏外膜蛋白酶。缺乏外膜蛋白酶的菌株可以降低表达的外源蛋白在细菌中被降解的程度，有利于获得完整的重组蛋白。
PLys 含编码T7溶菌酶的质粒；通过抑制T7 RNA聚合酶基础表达水平来降低T7启动的表达体系的基础表达水平。
ArgF 由于突变细菌不能利用arginine。
F’ 一个低拷贝可移动的质粒，当被M13噬菌体侵染时，可产生单链DNA。
LacI 编码lac抑制子，用于蓝白斑筛选时需加入IPTG，才可启动表达β-gal。
dam/dcm 消除了内源腺苷和鸟苷的甲基化。在此种细菌中繁殖的DNA不被甲基化
附:关于大肠杆菌
http://www.dxy.cn/bbs/thread/4335511
关于T载体
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1286939_1.html
(3)TA克隆常见问题分析及其解决方案
附表
(4)如何检测感受态细胞的效率
※ 为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率。
※ 计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落。
转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg。
转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×108 cfu/μg DNA。
(5)如何筛选重组菌落
◆ 可使用蓝/白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。
◆ 可对小量提取的质粒DNA做限制性酶切，采用天为时代公司的质粒提取试剂盒，可快速提取多个样本，而且由于提取的质粒纯度高，不会有酶切切不开，影响实验的情况。
◆ 也可直接用细菌菌落进行PCR反应，筛选存在目的片段的重组菌落。天为时代公司生产的一管便捷式PCR反应系统（MasterMix系列产品）特别适合这种方法。用灭菌的吸头挑取单个菌落到已加入MasterMix的PCR管中，加入特异引物，进行PCR扩增。扩增反应前在94℃变性5分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。将所得PCR产物在琼脂糖凝胶上检测扩增带。
◆ 另一种筛选重组菌落的方法是用插入片段特异引物进行菌落杂交。菌落生长后转移到固体支持物如硝酸纤维膜上，作原位裂解，使质粒附着到膜上，然后用核酸引物作杂交。多用于筛选稀有克隆菌落。
大家可以在以下基础上进行整理或对具体问题进行讨论
(1)如何筛选合适的宿主菌株
◇ 所选的宿主菌株应对所用质粒的抗生素抗性基因敏感。
◇ 如进行蓝/白斑筛选，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽编码区应在染色体或附加体上缺失掉（lacZΔΜ15）。TOP10和DH5α都能用于蓝/白斑筛选。
◇ 要表达重组蛋白，可使用带有可诱导的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21（DE3）。
◇ 使用pGEM载体克隆大片段时（>7-8 kb），经转化的菌株在30oC而不是在37oC生长，更有利于连接。作简单的亚克隆连接实验，亚克隆转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要，更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会，应用尽可能高转化效率的感受态细胞（>108克隆/μg DNA）。
(2)大肠杆菌基因型
hsdR 有利于非甲基化DNA（如PCR扩增产物）的有效转化。
mcrA 有利于甲基化DNA（如基因组）的有效转化。
acZΔM15 用于蓝白斑筛选。
endA1 无Endonuclease I 酶活性，有利于质粒的纯化。
recA1 减少克隆DNA的非特异性重组。
DE3 编码T7 RNA聚合酶，用于诱导T7-启动的表达系统的表达。
DeoR 可以高效吸收大片段DNA，有利于文库的构建。
Tn10 含 有四环素抗性的转座子。
OmpT 表明大肠杆菌缺乏外膜蛋白酶。缺乏外膜蛋白酶的菌株可以降低表达的外源蛋白在细菌中被降解的程度，有利于获得完整的重组蛋白。
PLys 含编码T7溶菌酶的质粒；通过抑制T7 RNA聚合酶基础表达水平来降低T7启动的表达体系的基础表达水平。
ArgF 由于突变细菌不能利用arginine。
F’ 一个低拷贝可移动的质粒，当被M13噬菌体侵染时，可产生单链DNA。
LacI 编码lac抑制子，用于蓝白斑筛选时需加入IPTG，才可启动表达β-gal。
dam/dcm 消除了内源腺苷和鸟苷的甲基化。在此种细菌中繁殖的DNA不被甲基化
附:关于大肠杆菌
http://www.dxy.cn/bbs/thread/4335511
关于T载体
http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1286939_1.html
(3)TA克隆常见问题分析及其解决方案
附表
(4)如何检测感受态细胞的效率
※ 为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率。
※ 计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落。
转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg。
转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为>1×108 cfu/μg DNA。
(5)如何筛选重组菌落
◆ 可使用蓝/白斑筛选法，在涂布有IPTG和X-Gal的筛选平板上，重组菌株为白色，未转入重组质粒的菌株为蓝色。
◆ 可对小量提取的质粒DNA做限制性酶切，采用天为时代公司的质粒提取试剂盒，可快速提取多个样本，而且由于提取的质粒纯度高，不会有酶切切不开，影响实验的情况。
◆ 也可直接用细菌菌落进行PCR反应，筛选存在目的片段的重组菌落。天为时代公司生产的一管便捷式PCR反应系统（MasterMix系列产品）特别适合这种方法。用灭菌的吸头挑取单个菌落到已加入MasterMix的PCR管中，加入特异引物，进行PCR扩增。扩增反应前在94℃变性5分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。将所得PCR产物在琼脂糖凝胶上检测扩增带。
◆ 另一种筛选重组菌落的方法是用插入片段特异引物进行菌落杂交。菌落生长后转移到固体支持物如硝酸纤维膜上，作原位裂解，使质粒附着到膜上，然后用核酸引物作杂交。多用于筛选稀有克隆菌落。
