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    人 T 细胞的克隆和扩增

    相关实验：人 T 细胞的克隆和扩增

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方案 精编免疫学实验指南, 第章

    材 料

    用可溶性抗原诱导特异性自体 T 细胞克隆时：
    外周 血 单 个 核 细 胞（P B M C ; 单 元 8.1)，来自抗原致敏的个体，作为反应细胞

    待 测 抗 原（抗原或抗原肽）

    照射灭活的自体或 H L A 匹配的同种异体 P B M C ，用作抗原呈递细胞
    E B V 转化的自体 B 细 胞（E B V -B 细胞；单 元 8. 16)，用作已知抗原的抗原呈递细胞

    特异性同种异体 T 细胞克隆时：

    P B M C ，来自健康志愿者，作为反应细胞

    照射灭活的同种异体 P B M C 或同种异体 E B V -B 细胞，作为刺激细胞

    T 细胞培养基
    3H T d R (推荐使用） V P B S (无 C a 2+ 及 M g 2+ ; 推荐使用） 0 . 0 5 % ( V / V ) 戊二醛， P B S 配制 24 孔 细 胞 培 养 板 （Linbro; H a m p t o n Research) 96 孔圆底细胞培养板 （Becton Dickinson Labware) 15ml 和 50ml 离 心 管 （Becton Dickinson Labware) la• 诱 导 特 异 性 自 体 T 细 胞 时 ： Ficoll-Hypaque密 度 梯 度 离 心 法 分 离 P B M C (单元 8.1)，在 2 4 孔细胞培养板中加入IO6 P B M C , 然后加入不同浓度的抗原肽或可溶性 抗 原 （〇. 1〜lO^g/ml) ，培养基总体积lml。 l b . 诱导 特 异 性 同 种 异 体 T 细胞时：用 IO6照 射 灭 活 （4 0 G y ) 的 同 种 异 体 P B M C 或 2 X 105照 射 灭 活 （5 0 G y ) 的同种异体E B V - B 细 胞 刺 激 IO6 P B M C (反应细胞）。 其 中，刺激细胞与反应细胞的H L A I类 或 H L A II类 抗 原 （分 别 用 于 C D 8 + 或 C D 4 + T 细胞的克隆）应不相容。 2 . 细 胞 置 37°C ， 5 % C〇 2细胞培养箱中培养10d ， 其间不需补充培养基和生长因子。 3 . 推荐操作：可在培养第5 天 各 取 100M1细胞悬液加入9 6 孔培养板中，评 估 反 应 性 T 细胞的增殖能力，每 组 设 2〜3 复孔。加 入 1/xCi (37kBq)3H T d R ，掺 入 4h 后 ，用 7 液闪仪检测cpm值 （单 元 8. 8) 。 检测特异性同种异体T 细胞的杀伤活性时，应采 用51C r 释 放 法 （单 元 8. 14)。 4 . 培养 第 1 0 天 ，收 集 细 胞 （应全部为T 细胞），然 后 洗 涤 并 计 数 （附 录 3 A )。 5 a . 特异性自体T 细胞：在 2 4 孔细胞培养板中，加 入 IO6上 述 激 活 的 T 细胞，再加入 适当浓度的抗原或抗原肽进行二次刺激，此时应同时加入IO6照 射 灭 活 （40G y ) 的 自体P B M C 或 E B V - B 细胞，培养基总体积lml。 5b. 特异性同种异体T 细胞：用 IO6照 射 灭 活 （40G y ) 的同种异体P B M C 或 E B V -B 细 胞 （50G y ) ，对 IO6 T 细胞进行二次刺激，细胞培养条件同初次刺激（步 骤 lb)。 E B V - B 细 胞 表 达 高 水 平 的 H L A I 类 或 H L A II类 抗 原 ，此 细 胞 非 常 适 合 用 于 抗 原 肽 的 呈 递 ；但 是 呈 递 原 始 抗 原 的 能 力 较 差 。 E B V - B 细 胞 也 可 用 戌 二 醛 固 定 ，方 法 如 下 ：对 于 可 溶 性 抗 原 ，将 E B V - B 细胞 与 1〜10M g / m l 抗 原 肽 预 孵 育 4 〜2 4 h 。 P B S 洗 涤 细 胞 2 遍 ，然 后 在 1 5 m l 离心管中 将 IO7个 细 胞 重 悬 于 Iml P B S 中。加 入 Iml 0 . 0 5 % 戌 二 醛 （P B S 配 制 ）， 室 温 固 定 30s。 加 入 2 m l P B S ， 孵 育 10min。 P B S 洗 涤 细 胞 2 遍 ， 然 后 用 培 养 基 洗 涤 1 遍即 可 。对 于 同 种 异 体 抗 原 ，戌 二 醛 固 定 的 E B V - B 细 胞 不 需 用 抗 原 肽 预 处 理 。 6 . 二次刺激后5〜7d 收集细胞，用培养基将细胞洗涤1 遍 ，然后计数。按 步 骤 2 培养 细胞并进行下一轮刺激，或者直接进行T 细 胞 克 隆 （见辅助方案1 ; 图 8. 15.1)。

    基本方案 2 T h l 或 Th2 细胞的诱导

    材 料

    人胳带血或新鲜分离的 P B M C (单元 8. 1)

    抗体 (如需要）：抗 C D 8、抗 C D 14、抗 C D 20、抗 C D 56、抗 血 型 糖 蛋 白 和（或）抗
    图 8 . 1 5 . 1 抗 原 特 异 性T 细胞的诱导。 MNC，单 个 核 细 胞 ； PBMC, 外 周血单个核细胞。 C D 45R O + 单抗 DNase (推荐使用） 小 鼠 纤 维 母 细 胞 （L 细胞）： C D 32 (FcyRII)、 C D 5 8 和 C D 8 0 c D N A 共转染后，照 射 灭 活 （40G y ) I M D M ，含 1 0 % F B S ， 0. lMm 滤器过滤除菌 抗 C D 3 单抗及抗C D 2 8 单 抗 （O K T -3、 U C H T -1、 9.3、 L 293或类似抗体） 诱导Thl 细胞时： rIL-2、 rIL-12 (Pepro Tech， R & D Systems) 及抗 IL-4 中和抗 体 （R & D Systems， Pharmingen) 诱导T h 2 细胞时： rIL-2、 rIL-4 (PeproTech， R & DSystems)、抗 IL-12 中和抗体 及抗 IFN-7 中 和 抗 体 （R & D Systems， Pharmingen)
    50m l肝 素 抗 凝 管 （用于收集脐带血） 2 4 孔细胞培养板 1 . 将人脐带血加入到50m l肝素抗凝管中， Ficoll-Hypaque密度梯度法离心分离单个核 细 胞 （ mononuclear cell， MNC) (单元8.1)。 或 者 ，采用新鲜分离的PBMC。 磁珠 法阴性分离脐带血CD4+ T 细胞或者外周血CD4 + 、 CD45R A + T 细 胞 ，所用抗体为 抗 CD8 、 抗 CD1 4 、 抗 CD2 0 和 抗 ⑶ 5 6 单 克 隆 抗 体 （一般情况下， IO6个细胞需用 Ifjtg抗体，单 元 8, 3 ) 。 用抗血型糖蛋白单抗去除M N C 中的红细胞。外 周 血 PBMC 分 离 CD4 + 、 CD45R A + T 细胞时，还应加入抗CD45RO+ 单克隆抗体。脐带血CD4+ T 细胞若需4 °C储存过夜，应 加 入 l ^ g/mlDNase。 2 . 在 2 4 孔细胞培养板中加入5 X 103照 射 灭 活 的 （40G y ) 且 表 达 C D 32、 C D 5 8 和 C D 80 的 L 细 胞 （L 细 胞 用 1 0 % FB S ^ M D M 培 养 ）。再 加 入 抗 C D 3 抗 体 使 终 浓 度 为 1/xg/ml， 置 37T：， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养2〜3h 。 3 . 吸弃悬浮细胞，贴壁细胞用0.5ml 1 0 % F B S^M D M 洗涤一次。如下所示，加 入 IO5 脐带血 CD4+ T 细 胞 或 CD4+ 、 CD45R A + T 细胞及相应的细胞因子及中和性抗体， 培养基终体积为lml。 a•诱导T h l 细胞时：加入相应终浓度的10ng/mlrIL-2、 lng/m U I L -12和 lO^g/ml 抗 IL- 4 中和抗体。 b•诱导 T h 2 细胞时：加入相应终浓度的 10ng/ml rIL-2、 20ng/ml rIL-4、 10/xg/ml 抗 IL-1 2 中和抗体及10Mg/m l 抗 IFN- 7 中和抗体。 4. 3d 后 ，加 入 0.5m l含 4ng/m lrIL- 2 的培养基。以后根据细胞生长情况，用含4ng/ml rIL- 2 的培养基传代。 5 . 培养第 6 天 ，收集细胞，用 1 0 % FBS/IM DM 洗涤细胞一次后，进 行 二 次 刺 激 （步骤 2〜 4)0 6 . 二次刺激后第6 天 ，收集细胞，检测上清中细胞因子分泌谱。方法如下：在包被有 抗 CD3 单抗和抗CD2 8 单 抗 的 2 4 孔 板 中 加 入 IO6个 细 胞 ，再 加 入 终 浓 度 为 2ng/ml 的 rIL- 2 , 培养基总体积1ml。 24〜48h 后收集细胞培养上清， E L ISA 检测上清中细 胞 因 子 的 水 平 （单 元 8. 10)。 胞 内 染 色 （单 元 5. 8 ) 和 ELISPOT检 测 （单 元 8. 11) 时，将 2 4 孔细胞培养板190g 离 心 2min，继续培养6h 后收集细胞。 ELISPOT检测 时 ，轻轻收集细胞，加 到 硝 酸 纤 维 素 孔 中 培 养 18h 。佛波酯和钙离子载体不影响 TCR/CD3 受体复合物介导的细胞活化，可 诱 导 分 泌 ThO样细胞因子谱，因此可作 为对照刺激。 细 胞 在 第 1 轮 刺 激 后 扩 增 10〜2 0 倍 ，在 第 2 轮 刺 激 后 扩 增 6〜 1 0 倍 。通 常 ，第 3 轮 刺 激 并 不 能 诱 导 细 胞 继 续 扩 增 。 在 rIL- 1 2 存 在 的 条 件 下 ，第 1 轮 刺 激 后 ，初 始 型 CD4+ T 细 胞 迅 速 分 化 为 分 泌 IFN- 7 的 T h l 细 胞 。在 rIL-4 存 在 的 条 件 下 ，细 胞 至 少 需 经 过 两 轮 刺 激 才 能 有 效 诱 导 Th2 细 胞 。 二 轮 刺 激 后 ， T h l 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子 水 平 为 ： IFN-y ， 3 〜 5ng/ (111卜106个 细 胞 ）； 1112细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子 水 平 为 ： 11>-4， <311§/(111undefined106 个细 胞 ）； IL-5， < 3 ng/(ml> 1 0 6 个 细 胞 ） • ， IL-1 0 ， 50ng/(m undefined 1 0 6 个 细 胞 ）

    ​

    来源：丁香实验

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