农杆菌介导的水稻转基因程序
丁香园论坛
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1双元载体的农杆菌转化
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。
1.3农杆菌转化子的PCR鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。
PCR反应参数设置：
94℃预变性3min 后开始以下循环反应：
94℃变性30秒，50℃退火1min ，72℃延伸1min，
35个循环后72℃继续延伸10min，反应结束后，取20μl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
PCR反应体系
母液 浓度 体积 终浓度
农杆菌转化子菌液体 2μl
P1 2μM 2μl 200nM
P2 2μM 2μl 200nM
10×PCR Buffer 2μl
Mg2+ 25mM 1.2μl 1.5mM
dNTP 2.5mM 1.2μl 150μM
Taq酶 5U/μl 0.2μl 1U
H2O 9.4μl
终体积 20μl
2. 根癌农杆菌介导的水稻转化
2.1. 水稻转化受体的准备
2.1.1. 水稻幼胚愈伤组织的诱导培养：取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2min，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90min，进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌) 用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
2.1.2. 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养：去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2min，然后用0.1%升汞浸泡30min，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。
2.2. 农杆菌的培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线,28℃黑暗培养3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5,加入AS，使AS终浓度为100mΜ,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
2.3. 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。
2.4. 抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
2.5. 抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
2.6. 生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。
培养基
诱导培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.5 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.8
继代培养基 同诱导培养基，但是2,4-D改为 2.0mg/L
共培养（固体）培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0mg/L + CH 500mg/l + 肌醇2000 mg/L + AS 100μM + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.5
(液体选择培养基无Gelrite)
选择培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0 mg/L + proline 500 mg/l +glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8
分化培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + NAA 0.1 mg/L + KT 4 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l
pH 5.8
生根培养基 1/2 MS/N6大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + 蔗糖 30g/l + Agar 0.8% pH 5.8
1.1农杆菌感受态细胞的制备
1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。
1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。
1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。
1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。
1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。
1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。
1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。
1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105
取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。
1.3农杆菌转化子的PCR鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中，28℃，220rpm摇培16hr，直接用菌液做PCR。
PCR反应参数设置：
94℃预变性3min 后开始以下循环反应：
94℃变性30秒，50℃退火1min ，72℃延伸1min，
35个循环后72℃继续延伸10min，反应结束后，取20μl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。
PCR反应体系
母液 浓度 体积 终浓度
农杆菌转化子菌液体 2μl
P1 2μM 2μl 200nM
P2 2μM 2μl 200nM
10×PCR Buffer 2μl
Mg2+ 25mM 1.2μl 1.5mM
dNTP 2.5mM 1.2μl 150μM
Taq酶 5U/μl 0.2μl 1U
H2O 9.4μl
终体积 20μl
2. 根癌农杆菌介导的水稻转化
2.1. 水稻转化受体的准备
2.1.1. 水稻幼胚愈伤组织的诱导培养：取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2min，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90min，进行表面灭菌。(灭菌时要经常搅拌) 用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
2.1.2. 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养：去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2min，然后用0.1%升汞浸泡30min，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。
2.2. 农杆菌的培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线,28℃黑暗培养3天,用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5,加入AS，使AS终浓度为100mΜ,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
2.3. 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可),室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。
2.4. 抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
2.5. 抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上,先暗培养3天,然后转至15h/d光照条件下培养,一般经过15-25天左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。
2.6. 生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。
培养基
诱导培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.5 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.8
继代培养基 同诱导培养基，但是2,4-D改为 2.0mg/L
共培养（固体）培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0mg/L + CH 500mg/l + 肌醇2000 mg/L + AS 100μM + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l pH 5.5
(液体选择培养基无Gelrite)
选择培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0 mg/L + proline 500 mg/l +glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8
分化培养基 MS（籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + NAA 0.1 mg/L + KT 4 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 mg/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l
pH 5.8
生根培养基 1/2 MS/N6大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + 蔗糖 30g/l + Agar 0.8% pH 5.8
