农杆菌介导的植物遗传转化

农杆菌介导的植物遗传转化　　

【目的】：学习和掌握共培养过程关键技术环节及转基因植株的筛选。　　

【要求】：以烟草叶片为材料，与对数生长期的带有外源基因的农杆菌共培养，遗传转化烟草叶片，筛选抗性再生植株。　　

【内容】：

1、烟草无菌苗的准备　　

2、带有外源基因农杆菌的培养　　

3、烟草叶片与对数生长期农杆菌的共培养　　

4、抗性再生植株的筛选　　

【用具】：超净工作台、摇床、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、培养瓶，培养皿、500 mL三角瓶、50 mL与500 mL烧杯、酒精灯、枪形镊子、手术刀。　　

【药品与水】：

① 按照培养基要求准备药品；

② 材料表面消毒剂：70%乙醇0.1% HgCl2

③ 无菌水；

④ 卡那霉素（kan）、羧苄青霉素(Cb)；

⑤ 带有外源基因的农杆菌由实验室提供。　　

培养基: 1、LB培养基100ml； 2、MS 盐溶液（pH 7.0）100ml,分装到50ml三角瓶中，25ml/ 瓶；3、 MS基本培养基 500ml(固体)； 4、分化培养基 MS+NAA 0.2 mg/l +6-BA 3 mg/l，500ml （固体），分装在250ml三角瓶中，每瓶100ml；高压灭菌　　

抗生素母液：Kan 100mg/ml 5ml ; Cb 500mg/ml 5ml 抽滤灭菌，分装在Ep 管中，每管1ml, -20℃保存。　　

实验材料】：烟草无菌苗叶片。　　

【方法】：　　

1. 取普通烟草无菌苗叶片，用锋利手术刀片切去边缘和主叶脉，叶片切成0.5 cm见方的小块（使四周均有伤口），备用。　　

2. 取培养过夜的农杆菌LBA4404（含有卡那霉素抗性基因，Gus基因）菌液，4,000 rpm，室温离心10 min，用MS盐溶液（pH 7.0）重新悬浮菌体，使用时用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。　　

3. 将准备好的的叶圆片在菌液中感染10 min后，将叶片取出,用无菌滤纸吸去植物材料表面菌液,转移到铺有一层无菌滤纸的MS培养基上，28℃暗培养，共培养3-7天。　　

4. 共培养后将材料转移到含有抗生素的分化培养基（筛选培养基） ( MS+NAA 0.2 mg/l +6-BA 3 mg/l+ Kan 100 μg/ml+ Cb 500 μg/ml)培养，每15天继代一次.　　

5．待抗性芽长到2-3 cm时切下，转至1/2 MS固体培养基上，生根培养基 (1/2MS+Kan 100 μg/ml+ Cb 500 μg/ml)诱导生根。　　

6. 利用 生物 化学和分子 生物 学方法检测这些转基因植株，每组用农杆菌介导法接种烟草叶片1平皿。