材料与仪器
缓释肥 乙酰丁香酮
盆钵 植物支撑器 LB 培养基 通用型试管 YEP 固体培养基 TSIM 培养基
盆钵 植物支撑器 LB 培养基 通用型试管 YEP 固体培养基 TSIM 培养基
步骤
一、材料
1. 母体植株的生长
( 1 ) 将母体植株种植于 12 , 7F ( 直径为 13 cm) 的盆钵中，每盆 4 株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 培养土，并施用 5 g/L 奥绿专用缓释肥（15 : 9 : 9+ 3 MgO + TE；释放周期达 5~6 个月），并在介质表层铺一薄层蛭石。
( 3 ) 用 Teku 植物支撑器（LBS Horticulture Colne Lancashire, UK) 来支撑植株。
( 4 ) 托盘中铺上 Aquamat ( LBS Horticulture)，每盘放 6 罐（底部宽 30 cm、长 50 cm 的深砾石托盘）。
( 5 ) 由 Octamitters 控制浇水。
( 6 ) 所使用的生长箱是 Conviron PGV/PGW 36。
2. 小量甘油农杆菌制备法
需要准备以下材料：
( 1 ) LB 培养基（Sigma- Aldrich)
( 2 ) 通用型试管（25 mL，Sterilin)
( 3 ) 85 : 15 的 LB 培养基/甘油溶液（Sigma- Aldrich)
3. 农杆菌制备及接种
需要准备以下材料：
( 1 ) YEP 固体培养基：5 g/L 酵母提取物，10 g/L 蛋白胨，5 g/L NaCl，15 g/L 琼脂，pH 6.8（以上均购自 Sigma- Aldrich) 。
( 2 ) TSIM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 100 mg/L 肌醇，10 g/L 蔗糖，500 mg/L MES 缓冲液（以上均购自 Sigma- Aldrich)，pH 5.2，过滤除菌。
( 3 ) 乙酰丁香酮（3 ,5 -diphenoxy- 4- hydroxyacetophenone) ( Sigma- Aldrich) ，0.1 mol/L 水溶液。
( 4 ) 25 μl 至 2.5 ml Hamilton 可重复使用的注射分液器（图 7.1)。
( 5 ) Hamilton 注射器（50 μl），带针头。
( 6 ) 量筒（500 ml)
( 7 ) 玻璃棒或类似的支持物
( 8 ) 透明塑料袋（455 mmx 600 mm)
( 9 ) Sanyo 多功能环境监测箱
4. 组织培养
需要用到以下材料：
( 1 ) Domestos 漂白剂（Lever Bros)
( 2 ) 乙醇溶液（70% V/V)：以去离子水配制
( 3 ) 无菌去离子水
( 4 ) 带 15 号刀片的手术刀（Swann-Morton，Sheffield，UK)
( 5 ) W4 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) ，2 mg/L 2，4-D，钠盐（Sigma- Aldrich) ，500 mg/L 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich) , 100 mg/L 酪蛋白水解物（Sigma-Aldrich) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma-Aldrich) ，150 mg/L 特美汀 ( ticarcillin disodium/potassium clavulanate) ( Melford Laborato ries Ipswich, UK)，pH 5.8 。表 7.1 列出了培养基添加剂的制备细节。
( 6 ) W425G 培养基：其余同 W4 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma-Aldrich )。
( 7 ) MRM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA, Germany) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma- Aldrich)，2 mg/L 激动素 ( SigmaAldrich)， pH 5.8 。
( 8 ) MRM25G 培养基：其余同 MRM 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma- Aldrich) 。
( 9 ) Beatson 广口瓶（250 ml，Richardsons, Leicester, UK) 以有盖培养皿的底作为盖子，并以 25 mm 3M Micropore 的胶带封口。
( 10 ) MS20 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（同前）， 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) , 7 g/L 经植物细胞培养测试过的琼脂（Sigma- Aldrich)，pH 5.8 。
( 11 ) Sanyo 多功能环境监测箱。
5. 转基因幼苗的生长
需要用到以下材料：
( 1 ) Jiffy 7 泥炭颗粒（Jiffy 产品， Norway)
( 2 ) 播种托盘及相应的 24 孔穴盘（可任选供应商）
( 3 ) 适合播种盘大小的培养箱（可任选供应商）
6. 转基因植株的生长
需要用到以下材料：
( 1 ) 12F（直径 12 cm）盆钵，每盆种一株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 的混合肥培养植株，并施以 5 g/L 奥绿专用缓释肥（同前）
( 3 ) 用 Pea sticks/split canes 作为支撑物。
( 4 ) 微孔面包袋（Focus Packaging) 用于套袋。
二、方法
1. 母株的生长
( 1 ) 将种子播至施有缓释肥的 M2 混合肥中（同上），深度为 2~3 cm ( 每罐 4 颗）。
( 2 ) 在盆的表层铺一薄层蛭石，以保持表层混合肥的质量。每罐放一个 Teku 植物支持器。
( 3 ) 把盆栽放在 Conviron 生长箱里，培养条件是白天 20℃、夜晚 15℃，16 h 光周期，400 μE/( m2·s ) 的光照（见注 1)。
2. 收获
( 1 ) 开花 16~18 天后收获分蘖，此时胚长至 1 mm 大小。从植株基部剪掉分蘖（见注 2 ) 。
( 2 ) 弃去底部的叶片，保留剑叶。
( 3 ) 将分蘖立即放入装有水的 500 ml 量筒中，修剪分蘖的长度以使剑叶正好位于量筒的顶部。
3. 脱粒
( 1 ) 去除每穗底部 2~3 个小穗。
( 2 ) 从下往上选取第一和第二朵花（图 7.2 ) ，小心地从花上去除颖片和外稃，仅使这两朵花的未成熟种子暴露出来。
( 3 ) 剪去干扰接种的残余组织，即未动过的花（如第三、第四朵花等）的外稃/颖片及芒，切忌损伤裸露的种子，否则会导致共培养时真菌的污染。
( 4 ) 用软刷向上刷穗以去除花药，否则也可能引起真菌生长。
( 5 ) 用湿纸巾擦拭叶片。
( 6 ) 轻轻地用 70%（V/V）乙醇喷穗部，使其在接种前干燥（见注 3) 。
4. 制备农杆菌平板
( 1 ) 制备少量含有质粒的甘油农杆菌。
( 2 ) 从母板上挑取一个单克隆，在加有相应抗生素的 LB 培养基 [ 16 ] 里，28℃ 剧烈振荡培养过夜。取 1 ml 到 Eppendorf 管中，10000 g 离心 30 s。去上清，并用 1 ml 加有 15%（m/V）甘油的 LB 重悬细胞。分装成小份，在 -80°C 保存。每次接种用一份新的甘油农杆菌，使用后弃之。
( 3 ) 接种实验前，用保存的甘油农杆菌在含有相应抗生素的 YEP 平板上划线，使整块平板上长满菌斑。
( 4 ) 封板，28℃ 培养 1 天，或者室温培养 3 天。
5. 农杆菌重悬
( 1 ) 用于接种的麦穗准备好之后，开始制备农杆菌的悬浮液。
( 2 ) 用乙醇擦拭并烧灼一个平头铲，使之充分冷却下来。
( 3 ) 用刮铲轻轻刮平板的表面来收集足量细菌，然后转移到含有 10 ml TSIM 和 400 μmol/L 乙酰丁香酮的 25 ml Universal 管中。应避免带上平板上的胶，因为这会影响接种过程。
( 4 ) 用 1 ml 的 Gilson 移液枪反复吹打重悬细菌，直到变为均匀的悬浊液。
6. 接种
( 1 ) 用 70%（V/V）乙醇对注射器进行消毒处理 4~5 次，然后用无菌水冲洗 4~5 次。确保针孔朝向自己。
( 2 ) 用注射器吸取农杆菌悬浮液。
( 3 ) 手握住穗部，使针尖可以接触到种子的胚。把针放入穗部使针尖大约位于胚乳和盾片的接合部（图 7.3)。盾片轻微的损伤不会产生影响，而且可作为正确接种的证据。
( 4 ) 每次缓慢按下按钮注射 1 μl 悬浮液。50 μl 的注射器，每按一次按钮注射 1 μl 悬浮液。
( 5 ) 对所有外露的种子重复这一过程。
( 6 ) 在所有穗都接种后，在量筒中放一个支持物（如玻璃棒），然后用透明的塑料袋覆盖并在底部封口。让其在 22°C、16 h 光周期、40 μE/( m2· s) 光照条件下生长 2~3 天（见注 4 ) 。
( 7 ) 用 70%（V/V）乙醇清洗注射器 4~5 次，用无菌水冲洗 4~5 次，再用 70% 乙醇洗一次，然后晾干。
7. 隔离
( 1 ) 接种 2~3 天后，将种子从穗上取下放入适合的有盖容器中。
( 2 ) 对种子进行表面消毒：70%（V/V）乙醇 1 min，20%（V/V）Domestos 漂白剂溶液 25 min，期间要搅拌。
( 3 ) 在滤网中用无菌去离子水彻底清洗。
( 4 ) 分离胚，然后放入 W4 培养基中，盾片向上，每皿放 25 个（见注 5) 。
( 5 ) 用 Parafilm 膜密封平板，然后在 28℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照条件下培养 5 天。
8. 组织培养
( 1 ) 5 天后，将胚轴从盾片上切除（见注 6 ) ，然后转移到新鲜的 W4 培养基上（见注 7) 。
( 2 ) 培养 12 天后，将愈伤组织移到选择培养基上（W4 25G ) 。在 25℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照条件下培养 2 周（接下来的操作都在这一温度和光照条件下进行）。
( 3 ) 选择 2 周后，将愈伤组织分成小块以便更好地接触到选择培养基，然后移到新鲜的 W4 25G 培养基上。
( 4 ) 继续选择培养 2 周后，将有活力的胚性愈伤移到含有选择试剂的再生培养基上( MRM 25 G)。 2 周后再进行一次转移，将还未发育成芽的愈伤移到新的 MRM 25G 培养基中。
( 5 ) 将再生的芽移到含有 MS20 的 Beatson 罐，然后让其在 25℃ 下培养（见注 8) 。
( 6 ) 让芽生长大约 1 个月，在这期间叶和根应该发育完全。
9. 土壤移植和炼苗
( 1 ) 用自来水湿润 Jiffy7 泥炭丸并放置于 24 孔穴盘中，将穴盘放到培植箱中。
( 2 ) 从 Beatson 罐中把苗移出，避免根部带上琼脂。
( 3 ) 将丛生的苗分开直至每一株苗只有一个芽。
( 4 ) 将苗移到 Jiffy 7 泥炭丸中，确保所有的根被 Jiffy 包埋，使得根能够接触到泥炭。去掉死的和将死的叶片。将生长中的叶片修整到 5~10 cm。在重新盖上培植箱盖前撒点水（见注 9 ) 。
( 5 ) 在 20℃ 生长 2 周后，如需要，植株可以用来做 PCR 检测和盆栽（见注 10)。
( 6 ) 为获得最大的产量，可将苗移到带 M2 培养土的 12F 罐 中（ 见上），每罐一株苗。在将苗转移到土壤的过程中不要去除 Jiffy 泥炭丸外的网以保持泥炭丸的完整。
( 7 ) 将开花的植株套袋以减少花粉的传播。
1. 母体植株的生长
( 1 ) 将母体植株种植于 12 , 7F ( 直径为 13 cm) 的盆钵中，每盆 4 株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 培养土，并施用 5 g/L 奥绿专用缓释肥（15 : 9 : 9+ 3 MgO + TE；释放周期达 5~6 个月），并在介质表层铺一薄层蛭石。
( 3 ) 用 Teku 植物支撑器（LBS Horticulture Colne Lancashire, UK) 来支撑植株。
( 4 ) 托盘中铺上 Aquamat ( LBS Horticulture)，每盘放 6 罐（底部宽 30 cm、长 50 cm 的深砾石托盘）。
( 5 ) 由 Octamitters 控制浇水。
( 6 ) 所使用的生长箱是 Conviron PGV/PGW 36。
2. 小量甘油农杆菌制备法
需要准备以下材料：
( 1 ) LB 培养基（Sigma- Aldrich)
( 2 ) 通用型试管（25 mL，Sterilin)
( 3 ) 85 : 15 的 LB 培养基/甘油溶液（Sigma- Aldrich)
3. 农杆菌制备及接种
需要准备以下材料：
( 1 ) YEP 固体培养基：5 g/L 酵母提取物，10 g/L 蛋白胨，5 g/L NaCl，15 g/L 琼脂，pH 6.8（以上均购自 Sigma- Aldrich) 。
( 2 ) TSIM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 100 mg/L 肌醇，10 g/L 蔗糖，500 mg/L MES 缓冲液（以上均购自 Sigma- Aldrich)，pH 5.2，过滤除菌。
( 3 ) 乙酰丁香酮（3 ,5 -diphenoxy- 4- hydroxyacetophenone) ( Sigma- Aldrich) ，0.1 mol/L 水溶液。
( 4 ) 25 μl 至 2.5 ml Hamilton 可重复使用的注射分液器（图 7.1)。
( 5 ) Hamilton 注射器（50 μl），带针头。
( 6 ) 量筒（500 ml)
( 7 ) 玻璃棒或类似的支持物
( 8 ) 透明塑料袋（455 mmx 600 mm)
( 9 ) Sanyo 多功能环境监测箱
4. 组织培养
需要用到以下材料：
( 1 ) Domestos 漂白剂（Lever Bros)
( 2 ) 乙醇溶液（70% V/V)：以去离子水配制
( 3 ) 无菌去离子水
( 4 ) 带 15 号刀片的手术刀（Swann-Morton，Sheffield，UK)
( 5 ) W4 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) ，2 mg/L 2，4-D，钠盐（Sigma- Aldrich) ，500 mg/L 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich) , 100 mg/L 酪蛋白水解物（Sigma-Aldrich) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma-Aldrich) ，150 mg/L 特美汀 ( ticarcillin disodium/potassium clavulanate) ( Melford Laborato ries Ipswich, UK)，pH 5.8 。表 7.1 列出了培养基添加剂的制备细节。
( 6 ) W425G 培养基：其余同 W4 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma-Aldrich )。
( 7 ) MRM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA, Germany) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma- Aldrich)，2 mg/L 激动素 ( SigmaAldrich)， pH 5.8 。
( 8 ) MRM25G 培养基：其余同 MRM 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma- Aldrich) 。
( 9 ) Beatson 广口瓶（250 ml，Richardsons, Leicester, UK) 以有盖培养皿的底作为盖子，并以 25 mm 3M Micropore 的胶带封口。
( 10 ) MS20 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（同前）， 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) , 7 g/L 经植物细胞培养测试过的琼脂（Sigma- Aldrich)，pH 5.8 。
( 11 ) Sanyo 多功能环境监测箱。
5. 转基因幼苗的生长
需要用到以下材料：
( 1 ) Jiffy 7 泥炭颗粒（Jiffy 产品， Norway)
( 2 ) 播种托盘及相应的 24 孔穴盘（可任选供应商）
( 3 ) 适合播种盘大小的培养箱（可任选供应商）
6. 转基因植株的生长
需要用到以下材料：
( 1 ) 12F（直径 12 cm）盆钵，每盆种一株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 的混合肥培养植株，并施以 5 g/L 奥绿专用缓释肥（同前）
( 3 ) 用 Pea sticks/split canes 作为支撑物。
( 4 ) 微孔面包袋（Focus Packaging) 用于套袋。
二、方法
1. 母株的生长
( 1 ) 将种子播至施有缓释肥的 M2 混合肥中（同上），深度为 2~3 cm ( 每罐 4 颗）。
( 2 ) 在盆的表层铺一薄层蛭石，以保持表层混合肥的质量。每罐放一个 Teku 植物支持器。
( 3 ) 把盆栽放在 Conviron 生长箱里，培养条件是白天 20℃、夜晚 15℃，16 h 光周期，400 μE/( m2·s ) 的光照（见注 1)。
2. 收获
( 1 ) 开花 16~18 天后收获分蘖，此时胚长至 1 mm 大小。从植株基部剪掉分蘖（见注 2 ) 。
( 2 ) 弃去底部的叶片，保留剑叶。
( 3 ) 将分蘖立即放入装有水的 500 ml 量筒中，修剪分蘖的长度以使剑叶正好位于量筒的顶部。
3. 脱粒
( 1 ) 去除每穗底部 2~3 个小穗。
( 2 ) 从下往上选取第一和第二朵花（图 7.2 ) ，小心地从花上去除颖片和外稃，仅使这两朵花的未成熟种子暴露出来。
( 3 ) 剪去干扰接种的残余组织，即未动过的花（如第三、第四朵花等）的外稃/颖片及芒，切忌损伤裸露的种子，否则会导致共培养时真菌的污染。
( 4 ) 用软刷向上刷穗以去除花药，否则也可能引起真菌生长。
( 5 ) 用湿纸巾擦拭叶片。
( 6 ) 轻轻地用 70%（V/V）乙醇喷穗部，使其在接种前干燥（见注 3) 。
4. 制备农杆菌平板
( 1 ) 制备少量含有质粒的甘油农杆菌。
( 2 ) 从母板上挑取一个单克隆，在加有相应抗生素的 LB 培养基 [ 16 ] 里，28℃ 剧烈振荡培养过夜。取 1 ml 到 Eppendorf 管中，10000 g 离心 30 s。去上清，并用 1 ml 加有 15%（m/V）甘油的 LB 重悬细胞。分装成小份，在 -80°C 保存。每次接种用一份新的甘油农杆菌，使用后弃之。
( 3 ) 接种实验前，用保存的甘油农杆菌在含有相应抗生素的 YEP 平板上划线，使整块平板上长满菌斑。
( 4 ) 封板，28℃ 培养 1 天，或者室温培养 3 天。
5. 农杆菌重悬
( 1 ) 用于接种的麦穗准备好之后，开始制备农杆菌的悬浮液。
( 2 ) 用乙醇擦拭并烧灼一个平头铲，使之充分冷却下来。
( 3 ) 用刮铲轻轻刮平板的表面来收集足量细菌，然后转移到含有 10 ml TSIM 和 400 μmol/L 乙酰丁香酮的 25 ml Universal 管中。应避免带上平板上的胶，因为这会影响接种过程。
( 4 ) 用 1 ml 的 Gilson 移液枪反复吹打重悬细菌，直到变为均匀的悬浊液。
6. 接种
( 1 ) 用 70%（V/V）乙醇对注射器进行消毒处理 4~5 次，然后用无菌水冲洗 4~5 次。确保针孔朝向自己。
( 2 ) 用注射器吸取农杆菌悬浮液。
( 3 ) 手握住穗部，使针尖可以接触到种子的胚。把针放入穗部使针尖大约位于胚乳和盾片的接合部（图 7.3)。盾片轻微的损伤不会产生影响，而且可作为正确接种的证据。
( 4 ) 每次缓慢按下按钮注射 1 μl 悬浮液。50 μl 的注射器，每按一次按钮注射 1 μl 悬浮液。
( 5 ) 对所有外露的种子重复这一过程。
( 6 ) 在所有穗都接种后，在量筒中放一个支持物（如玻璃棒），然后用透明的塑料袋覆盖并在底部封口。让其在 22°C、16 h 光周期、40 μE/( m2· s) 光照条件下生长 2~3 天（见注 4 ) 。
( 7 ) 用 70%（V/V）乙醇清洗注射器 4~5 次，用无菌水冲洗 4~5 次，再用 70% 乙醇洗一次，然后晾干。
7. 隔离
( 1 ) 接种 2~3 天后，将种子从穗上取下放入适合的有盖容器中。
( 2 ) 对种子进行表面消毒：70%（V/V）乙醇 1 min，20%（V/V）Domestos 漂白剂溶液 25 min，期间要搅拌。
( 3 ) 在滤网中用无菌去离子水彻底清洗。
( 4 ) 分离胚，然后放入 W4 培养基中，盾片向上，每皿放 25 个（见注 5) 。
( 5 ) 用 Parafilm 膜密封平板，然后在 28℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照条件下培养 5 天。
8. 组织培养
( 1 ) 5 天后，将胚轴从盾片上切除（见注 6 ) ，然后转移到新鲜的 W4 培养基上（见注 7) 。
( 2 ) 培养 12 天后，将愈伤组织移到选择培养基上（W4 25G ) 。在 25℃、16 h 光周期、80 μE/(m2·s) 光照条件下培养 2 周（接下来的操作都在这一温度和光照条件下进行）。
( 3 ) 选择 2 周后，将愈伤组织分成小块以便更好地接触到选择培养基，然后移到新鲜的 W4 25G 培养基上。
( 4 ) 继续选择培养 2 周后，将有活力的胚性愈伤移到含有选择试剂的再生培养基上( MRM 25 G)。 2 周后再进行一次转移，将还未发育成芽的愈伤移到新的 MRM 25G 培养基中。
( 5 ) 将再生的芽移到含有 MS20 的 Beatson 罐，然后让其在 25℃ 下培养（见注 8) 。
( 6 ) 让芽生长大约 1 个月，在这期间叶和根应该发育完全。
9. 土壤移植和炼苗
( 1 ) 用自来水湿润 Jiffy7 泥炭丸并放置于 24 孔穴盘中，将穴盘放到培植箱中。
( 2 ) 从 Beatson 罐中把苗移出，避免根部带上琼脂。
( 3 ) 将丛生的苗分开直至每一株苗只有一个芽。
( 4 ) 将苗移到 Jiffy 7 泥炭丸中，确保所有的根被 Jiffy 包埋，使得根能够接触到泥炭。去掉死的和将死的叶片。将生长中的叶片修整到 5~10 cm。在重新盖上培植箱盖前撒点水（见注 9 ) 。
( 5 ) 在 20℃ 生长 2 周后，如需要，植株可以用来做 PCR 检测和盆栽（见注 10)。
( 6 ) 为获得最大的产量，可将苗移到带 M2 培养土的 12F 罐 中（ 见上），每罐一株苗。在将苗转移到土壤的过程中不要去除 Jiffy 泥炭丸外的网以保持泥炭丸的完整。
( 7 ) 将开花的植株套袋以减少花粉的传播。
来源：丁香实验
