农杆菌介导ACC脱氨酶基因转化新疆哈密瓜的研究

农杆菌介导ACC脱氨酶基因转化新疆哈密瓜的研究

 

 

李晓荣1   廖  康2     宫江平3   赵长生4   王  惠4

 

 

1 新疆农科院核生所，乌鲁木齐备 830000  2 新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐备 830000

 

3 新疆农科院园艺所，乌鲁木齐备 830000  4 中国科学院新疆分院生态与地理研究所，乌鲁木齐备 830000

 

 

 

关键词：哈密瓜  ACC脱氨酶基因  乙烯

 

 

 

新疆素有“瓜果之乡”的美称，作为新疆的特色产品―哈密瓜则更是名扬海内外。应用转基因技术开辟一条新的保鲜途径，从遗传性调整生理功能，提高哈密瓜的保鲜性能。ACC脱氨酶可将ACC降解为丁酮酸和氨气,从而降低植物体内乙烯含量，达到控制果实成熟的目的，延缓哈密瓜采后迅速成熟和衰老，使果实有较长保鲜期、抗裂抗机械损伤、抗真、细菌继发性感染等特性。有利于外运、延长货架期，可以培育稳固的哈密瓜市场，也可避免采摘期的过分集中，调节季节性供应货期向周年方向发展。

 

1  材料与方法

 

1.1  供试材料及实验地点

 

    皇后、伽师瓜种子由新疆农科院园艺所提供。本实验在新疆农业大学园艺学院组织培养实验室完成。

 

1.2   农杆菌菌株

 

    大肠杆菌DH5α为受体菌，克隆质粒为PUC19，植物表达载体为PROKⅡ，根癌农杆菌菌株LBA4404,由中国科学院北京微生物所提供。具有ACC脱氨酶基因，长度为1kb,位于表达载体pROKⅡ35s上。

 

1.3  实验方法

 

1.3.1 哈密瓜无菌苗的获得  分别取皇后、伽师瓜种子去皮,70%的酒精溶液浸泡1min,再用0.1%的升汞溶液消毒6～8min,无菌水冲洗3遍后接种于MS培养基中进行培养。要求培养室温度为28±1℃,光照3 000Lx左右，每日光照14～16h 〔1〕。

 

1.3.2 哈密瓜转化植株的获得  根据对子叶日龄、外植体种类、外源激素浓度配比〔2〕、AgNO3的用量、琼脂、及蔗糖浓度等与植株再生相关的因素进行分阶段实验，获得再生植株。根据对菌液浓度、AS（乙酰丁香酮）浓度、侵染时间、共培养时间（暗培时间）、Amp（氨苄青霉素）浓度、km（卡那霉素）浓度、GA3浓度等进行梯度实验〔3〕，确定获得转化植株的培养基配方。

 

（1） 农杆菌工程菌液的制备

 

在含km100mg.l-1和利福霉素100mg.l-1的LB固体培养基上取试管斜面保存的农杆菌划线，约40h后挑取单菌落于的LB液体培养基中，振荡培养20h左右.收集菌体用MS液悬浮，加入AS200µmol.l-1， 振荡培养4h。要求菌液的OD值约为0.3～0.5(600nm)。 

 

（2） 哈密瓜外植体的侵染

 

分别取皇后、伽师瓜4～5日龄子叶，切成0.5×0.5cm小块，根据品种确定其侵染时间，对照子叶侵染MS液。侵染后取出子叶块，用无菌滤纸充分吸干，然后接种于共培养培养基MS+BA1.0mg.l-1 +蔗糖30g.l-1+琼脂7.5g.l-1，置于暗室进行共培养（28±1℃）。

 

（3） 哈密瓜转化植株的再生

 

两日后将共培养的子叶块取出，无菌水冲洗4遍后接种于脱菌培养基（MS+BA1.0mg.l-1+Amp400mg.l-1）。两日后转接于MS+BA1.0mg.l-1+Amp400mg.l-1+Km50mg.l-1的分化培养基上，20日后根据分化状况逐渐降低细胞分裂素的浓度，进行继代培养（MS+BA0.8-0.2mg.l-1+Amp400mg.l-1+Km75mg.l-1+GA30.5mg.l-1）。待分化出的芽长至2-3 cm时，接种于1/2MS+IBA1.0mg.l-1+ GA30.2mg.l-1 +Amp200mg.l-1+Km50mg.l-1的生根培养基中。（以上培养基均加入AgNO3 6mg.l-1，蔗糖及琼脂用量参照共培养培养基,pH5.8。）

 

1.4  转化植株的检测

 

1.4.1  转化植株的km抗性检测〔4〕  将转化植株的顶芽及未转化植株（对照株）的顶芽接种于含km(50mg.L-1)的生根培养基中，观察其生长及生根情况。

 

1.4.2  转化植株目的基因的PCR检测  转化植株DNA的提取参照巩振辉的微量DNA的提取方法〔5〕，略作改动。 农杆菌Ti质粒DNA的提取参照分子克隆实验指南（第二版）〔6〕：

 

（1） 植物DNA及质粒DNA的检测

 

分别取植物DNA及质粒DNA5µl，加入1µl上样缓冲液在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳40min，用溴化乙锭染色20min,紫外灯下观察。

 

（2） PCR目的基因的扩增

 

根据目的基因序列合成引物。

 

引物1：5’GCG TTC AGC CGT CTC GGA AG 3’

 

引物2：5’CCA TGA ACC TGC ACC GAT TC 3’

 

PCR反应在0.5ml Eppendorf 管中进行，反应总体积为25µl。95℃预变性5min后，按三温体系共35个循环：95℃变性1min,54℃退火1min,72℃延伸2min，反应结束后，72℃再延伸5min。

 

（3） PCR扩增产物的检测

 

分别取扩增产物10µl，加入溴酚兰于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，用λDNA/EcoRⅠ-HindⅢ标准分子量作为Marker。

 

1.5  叶片乙烯生成量测定

 

用打孔器取功能叶片100片，置密闭小瓶中，每隔0.5h测定一次乙烯释放量，连续测定3h,每个样品设置三次重复。从小瓶中抽取500µl气体，用岛津GC-9A气相色谱仪分析。

 

1.6  叶片过氧化物同工酶电泳

 

方法参照生物化学实验方法与技术〔7〕，略有改动。

 

2  结果与分析

 

2.1  农杆菌介导的遗传转化

 

2.1.1  哈密瓜外植体的侵染  哈密瓜子叶的分化具有极性现象〔8〕，选择靠近胚轴的子叶块作为外植体进行侵染。由于品种有差别，经实验确定伽师瓜子叶的侵染时间为5min,皇后的为8min。实验表明，菌液中加入AS，提高了农杆菌侵染外植体伤口的能力。

 

2.1.2 哈密瓜转化植株的再生  农杆菌在黑暗条件下繁殖迅速，易于通过伤口进入外植体。外植体于共培养培养基中暗培2d可提高转化率。

 

表1  哈密瓜未侵染子叶与侵染子叶的再生比较

 

 

 

接种量

 

愈伤组织分化率（%）

 

芽分化率

 

（%）

 

绿苗率（%）

 

生根时间（d）

 

生根量

 

（条）

 

未侵染子叶

 

100

 

87

 

77

 

75

 

7.6

 

7.4

 

侵染子叶

 

100

 

92

 

26

 

3

 

13.2

 

16.5

 

由上表可以看出，经侵染的外植体（子叶块）在4～7d后可以见到明显的愈伤组织生成，其分化率略高于对照（未侵染子叶），但产生愈伤组织及进行分化的时间明显延后，其分化成芽的能力显著降低，获得的绿苗数也相差较多。培养基中加入适量AgNO3，未侵染子叶的芽分化率由72%提高到77%〔9〕。在植株生长过程中可观察到，对照苗的节间长于转化苗；其发根速度快，平均为7.6d可见到第一条新根，主根数量较转化苗少，根系粗壮发达，有明显的主根及须根（见图版1），而转化苗生根较慢，平均需13.2d，发根数量比对照苗多，但其根系较细,无明显的主根（见图版2）。

 

2.2  哈密瓜转化植株的检测

 

2.2.1  转化植株的km抗性检测结果  将转化植株的顶芽及对照株的顶芽接种于含km(50mg.L-1)的生根培养基中，8-10d后即可发现，对照株叶片逐渐黄化、白化，顶部开始萎蔫，不再有任何生长趋势，15d后整株死亡；转化植株不断生长，叶片保持绿色，8～15d后有白色的根出现，25～30d后可长成一株完整植株（见图版3）。

 

2.2.2  转化植株目的基因的PCR检测结果  

 

（1）植物DNA及质粒DNA的检测结果

 

将植物DNA及质粒DNA进行电泳后观察，在紫外灯下仅出现一条丫啶橙色的条带，可以利用这些样品作为PCR体系中的模板进行下一步实验。

 

（2）目的基因的PCR检测结果

 

经过对PCR扩增产物进行电泳，其结果见图1。（删）

 

由图1可看出，对照植株（阴性对照）未出现扩增条带，经过km 筛选的6株转化植株中的4株4、5、6和9（T1，T2，T3和T6）及质粒（阳性对照）在分子量为1 kb的位置上出现了目的基因的特异性扩增，说明ACC脱氨酶基因已通过农杆菌介导进入了哈密瓜组织，并整合到其染色体DNA上；而经过km 筛选的植株7和8（T4、T5）并未在相应位置出现扩增 条带，因此判断为假阳性植株。

 

2.3  叶片乙烯生成量的测定

 

植物在受到伤害时会产生大量的伤乙烯〔10〕，测定对照植株及转化植株叶片受伤后乙烯的释放量，结果见图2：

 

由图可知，皇后对照植株叶片在受到伤害后，在0.5h 内就达到14.21nl.l-1，1.5h时，乙烯释放量达到最大，为20.43nl.l-1，然后急剧下降，到3h时，乙烯释放量降低到9.82nl.l-1。而转化植株T3叶片在受到伤害时，乙烯的释放量较少，0.5h为3.98nl.l-1, 1.5h时，为5.28 nl.l-1,没有乙烯生成高峰期，表明转基因植株叶片中由于有ACC脱氨酶基因的存在，乙烯的生成受到抑制。在乙烯生成高峰期，转基因植株叶片的乙烯生成仅为对照的20.9%。

 

而转化植株T1在测定过程中，也出现了乙烯的产生高峰期，说明ACC脱氨酶基因在植株中没有进行有效表达。 

 

2.4  过氧化酶同工酶电泳

 

过氧化酶同工酶电泳结果显示，转化植株3、4、6（T2、T3、T6）叶片的过氧化物同工酶比对照植株叶片1、7的过氧化物同工酶多出现一条颜色浅而窄的酶带E，其泳动迁移率（Rf）值为0.53。可能是因为ACC脱氨酶基因的导入使得转化植株中编码这类酶的某些基因得以表达。而转化植株2（T1），抗Km植株5（T4）的过氧化物同工酶条带与对照植株相同。

 

3  讨论与结论

 

本实验选用2个优质新疆哈密瓜品种：伽师瓜和皇后,通过农杆菌介导法进行遗传转化获得抗km的植株。PCR检测结果初步证明1kb的ACC脱氨酶基因已导入4株皇后植株中。

 

对转化植株和非转化植株的叶片测定伤乙烯可知，转化植株叶片在受到伤害时,伤乙

 

烯的合成受到一定程度的抑制。

 

同工酶作为基因的直接产物，用其作为遗传标记，可以提供重要的遗传信息〔10〕。对于组织培养所获得的再生植株和转基因植株，由于芽及根的分化并不完全一致，移栽后植株受到内在因素和外界因素的影响，不同植株的发育时期不能保证完全是同期的。对于本实验中的结果只是作为一种实验方法的结果予以借鉴。