【专题讨论】外源DNA和质粒载体的连接反应
丁香园论坛
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a.将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中,加等摩尔量的外源DNA。
b.加水至7.5μl,于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链,将混合物冷却到0℃。
c.加入:10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl
T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃温育1-4小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)
该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。
另外,再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商(除New England Biolabs公司外)现在都用Weiss等,11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时,1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位(Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位(如New England Biolabs公司所定义)。因此,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段(5μg)得以连接。在本书中,T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1-5单位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。
3)每个样品各取1-2μl转化大肠杆菌感受态细胞。
(三)平端DNA连接
T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。然而,相对而言,平端连接是低效反应,它要求以下4个条件:
1)低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2)不存在亚精胺一类的多胺。
3)极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。
4)高浓度的平端。
1.凝聚剂
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中,这些物质具有两作用:
1)它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级,因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
2)它们可以改变连接产物的分布,分子内连接受到抑制,所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样,即使在有利于自身环化(j:i=10)的DNA浓度下,所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时,下列资料可供参考。
(1)聚乙二醇(PEG8000)
1)用去离子水配制的PEG8000贮存液(40%)分装成小份,冰冻保存,但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中,对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外,其他所有连接混合物的组分应于0℃混合,然后加适当体积的PEG 8000(处于室温),混匀,加酶后于20℃进行温育。
2)连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著,甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低,都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3)浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍,反应的主产物是串联的多联体。
4)PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接,在这一方面,它与氯化六氨合高钴有所不同。
(2)氯化六氨合高钴
1)氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时,其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部,但只能使端连接的效率提高到原来的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2)在单价阳离子(30mmol/L KCl)存在下,它对平端连接仍有一定的刺激作用,但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物,相反,环状DNA将点尽优势。
3)与PEG 8000不同,氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。
b.加水至7.5μl,于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链,将混合物冷却到0℃。
c.加入:10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl
T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃温育1-4小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)
该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。
另外,再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商(除New England Biolabs公司外)现在都用Weiss等,11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时,1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位(Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位(如New England Biolabs公司所定义)。因此,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段(5μg)得以连接。在本书中,T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1-5单位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。
3)每个样品各取1-2μl转化大肠杆菌感受态细胞。
(三)平端DNA连接
T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。然而,相对而言,平端连接是低效反应,它要求以下4个条件:
1)低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。
2)不存在亚精胺一类的多胺。
3)极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。
4)高浓度的平端。
1.凝聚剂
在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中,这些物质具有两作用:
1)它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级,因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。
2)它们可以改变连接产物的分布,分子内连接受到抑制,所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样,即使在有利于自身环化(j:i=10)的DNA浓度下,所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时,下列资料可供参考。
(1)聚乙二醇(PEG8000)
1)用去离子水配制的PEG8000贮存液(40%)分装成小份,冰冻保存,但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中,对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外,其他所有连接混合物的组分应于0℃混合,然后加适当体积的PEG 8000(处于室温),混匀,加酶后于20℃进行温育。
2)连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著,甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低,都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。
3)浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍,反应的主产物是串联的多联体。
4)PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接,在这一方面,它与氯化六氨合高钴有所不同。
(2)氯化六氨合高钴
1)氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时,其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部,但只能使端连接的效率提高到原来的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。
2)在单价阳离子(30mmol/L KCl)存在下,它对平端连接仍有一定的刺激作用,但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物,相反,环状DNA将点尽优势。
3)与PEG 8000不同,氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。