外源DNA和质粒载体的连接反应

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。

DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。

如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这倦，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。

Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。

这样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数，M是DNA的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。

因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系（Dugaiczyk等，1985）。

现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。

当i是j的2－3倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源DNA末端浓度的2倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源DNA的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：

1）足量的载体DNA，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。

2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

粘端连接

1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

2）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0℃。

c．加入：10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl

T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位

5mmol/L ATP 1μl

于16℃温育1－4小时

10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（组分V.Sigma产品）（可用可不用）