外源DNA和质粒载体的连接反应

外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。

DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。

如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这倦，在DNA浓度低时，质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。

Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)从理论上探讨了DNA浓度对连接产物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。

这样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数，与DNA深度无关。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数，M是DNA的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。

因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。图1.9显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系（Dugaiczyk等，1985）。

现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响， 而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。

当i是j的2－3倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源DNA末端浓度的2倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源DNA的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：

1）足量的载体DNA，以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。

2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

粘端连接

1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

2）按如下所述设立连接反应混合物：

a．将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0℃。

c．加入：10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl

T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位

5mmol/L ATP 1μl

于16℃温育1－4小时

10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫苏糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（组分V.Sigma产品）（可用可不用）

该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。

另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DNA，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，11968)对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如New England Biolabs公司所定义）。因此，0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。在本书中，T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。

3）每个样品各取1－2μl转化大肠杆菌感受态细胞。

（三）平端DNA连接

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于DNA很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：

1）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2）不存在亚精胺一类的多胺。

3）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。

4）高浓度的平端。

1．凝聚剂

在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：

1）它们可使平端DNA的连接速率加大1－3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。

2）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的DNA浓度下，所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。

（1）聚乙二醇（PEG8000）

1）用去离子水配制的PEG8000贮存液（40%）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于0℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。

2）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl₂时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或MgCl₂浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

3）浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。

4）PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。

（2）氯化六氨合高钴

1）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

2）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将点尽优势。

3）与PEG8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。