【原创】TILLING 技术原理及其在植物功能基因组中应用进展
丁香园论坛
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目前关于TILLING 技术炒得比较火，笔者正在从事这方面的工作，搜索论坛里
对该技术讨论得不是很多，从目前形势看TILLING 技术技术将会广泛应用。
于是就自己所了解的东西写出来供大家研究，同时也希望有兴趣者和我
交流
希望加分
TILLING 技术原理及其在植物功能基因组中应用进展
TILLING， 即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向诱导基因组局部突变技术)，是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikof领导的研究小组发展起来的，是一种全新的反向遗传学研究方法。主要的技术论文先后发表在Plant Physiology、Nature Biotechnology 、Genome Research 等学术刊物上。TILLING已成为自动化反向遗传学解决方案的关键词，以美国为首的北美实验室借助高通量的TILLING技术，启动了拟南芥TILLING项目(Arabidopsis TILLING Project)，获得美国国家科学基金会植物基因组计划(Plant Genome Re—searchProgram，PGRP)大力资助，在ATP项目组内部已经实现了材料、DNA样品及突变信息的充分共享，该项目在立项的第一年里就为拟南芥研究者们提供了超过100个基因上的l000多个突变位点。从最近研究来看，TILLING技术仍在应用于初步阶段，多半应用于突变体的构建。而体变体的利用和大范围基因功能筛选目前还处于初步摸索阶段。从最近几次国际性的基因组大会和相关文献上看，TILLING技术已经应用于除拟南芥之外的多数农作物上，另外在动物上如线虫，斑马鱼都已经利用TILLING技术构建了突变体库。但做的比较前沿的都是在农作物，其中，小麦，豆科模式植物，马铃薯等植物已经做出了初步成果。目前在国内已有几家单位应用TILLING技术做功能基因组研究。主要有上海植生所得白菜，华中农大国家遗传改良实验室的甘蓝型油菜和水稻等。本文就TILLING技术原理及其应用现状作一介绍。
1． TILLING技术路线
TILLING技术是基于人为的化学诱变产生突变位点，然后将这些突变位点转化为可以遗传的位点，最终利用检测突变位点
的技术筛选出带有突变位点的个体，从而达到可以利用这些突变位点分析基因功能的目的。
1.1诱变产生突变位点
就目前来看，诱变是产生突变的最主要方式。而针对TILLING而言所采用的是化学诱变，目前从研究上看一般采用EMS或ENU突变剂。多半采用EMS突变，因为TILLING技术所主要针对的是SNP突变位点，而EMS是单碱基突变剂。从诱变材料看，诱变多半是对植物的种子进行浸泡突变。也有少数是对花粉进行诱变，然后再利用小孢子培养技术将这些被诱变了的花粉粒培养成植株再经过染色体加倍技术纯合突变位点形成突变体库。这在玉米里已经应用成功，这种技术难度较高，要有很好的小孢子培养技术，同时经过诱变了的小孢子在培养成植株过程中难度很大。所以目前一般采用诱变种子的办法。在诱变时最重要的就是诱变剂的浓度，浓度太低要达到构建突变体库的目的需要的群体就大，筛选工作量加大，浓度高，群体会小，工作量大范围变小，但是高浓度的诱变会给植株生长带来很大的影响。会造成不育，或者诱变致死，因此一定要掌握好突变剂浓度。从目前来看，诱变剂（针对EMS）浓度在0.3%-1.5%之间。一般而言，在诱变后成活率达到10%，不育率在50%左右为最理想浓度
1.2可遗传的突变位点传代形成突变体库
由于TILIING技术多半采用的是诱变种子。而种子是一个多细胞体系，从植物发育的角度讲，只有在位于胚胎的顶端分生组织的能发育成生殖组织的细胞里的基因发生突变才能遗传到下一代，因此，由突变的种子产生的M1代植株是嵌合体，不能作为突变体库材料，必须经过纯合一代才能形成突变体库。因此，目前所采取的大多数方案是，M1植株套袋自交，产生M2 种子，M2植株长成后所包含的突变位点都能在突变体库里被我们利用。一般而言，一个可以产生下一代的M1植株产生4-200个M2 植株，这些M2植株从遗传背景上说多半是含有不同的突变位点的。此时，就可以提取M2植株的DNA作遗传分析，筛选突变位点。同时每个M2 植株自交形成M3 种子，该M3种子形成突变种子库，这些来自于不同M2单株的M3种子要和DNA库一一对应，以便在DNA水平上筛选出突变位点与表型对应分析。
1.3突变位点的筛选
从M2 植株中提取得DNA是含有单碱基突变位点。TILLING技术所采用的检测这些SNP的方案是利用这些含有不同突变位点的M2 DNA形成一个POOL，一般是4-16个M2 混合成一个POOL，视材料而定。然后经过聚合酶链式反应扩增出想要研究的基因片断，这些DNA片断经过变性、退火后就会形成一些不匹配的DNA双链，而S1酶（如CEL1）又能识别这些不匹配的双链进行切割，再进行变性后，在所在的POOL中就会出现一些分子量变小的DNA片断，而这些片断本身是经过荧光标记的，因此经过检测就知道该DNA POOL中含有突变体。然后对具有突变位点得POOL进行单个M2 检测突变位点，见下图。
1.4 TILLING引物的设计
在筛选突变位点时，形成DNA池后是要对感兴趣的基因或序列进行PCR扩增。而对感兴趣的基因或序列进行扩增的关键是如何设计好高效引物。EMS是针对G/C突变为A/T的，因此在G/C含量高的区域必定突变频率高。所以，TILLING引物设计上就要根据这一点设计。目前，基本上都是应用CODDLE来设计引物，它是是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikof领导的研究小组设计的专门针对TILLING引物设计的网上引物设计软件，它基本原理是根据已知序列信息，包括序列、编码序列等信息，找出G/C含量最高的外显子区域，然后再基于Primer3设计引物。TILLING引物设计的前提条件是要知道自己想研究基因的序列信息。
2．TILLING技术评价
TILLING技术的关键在于LI-COR公司开发的双色荧光标记（７００nm和８００nm）和能识别该荧光的激光头。利用该荧光标记引物能够使扩增产物被识别，从而达到筛选的目的。而TILLING技术创新性在于能高通量检验单碱基突变。从该技术出现以前，ＳＮＰ是很难检测到的。但是TILLING技术利用了带有ＳＮＰ的ＤＮＡ片断形成的不匹配的ＤＮＡ双链的性质，结合单链核酸酶的切割不匹配区域，然后利用ＤＮＡ片断变短筛选的方法筛选到带有ＳＮＰ的ＤＮＡ片断。同时还利用形成ＤＮＡ池的这种做法大大提高筛选速度，从而达到完全的高通量。
但是，该技术也有其不可忽视的缺点。利用该技术进行反向遗传学研究的前提条件是要知道所研究基因的序列，这在目前来说对许多植物而言是做不到的。其次，在多倍体植物里面，如甘蓝型油菜，小麦等植物，本身就是多基因组，那么不同基因组之间一般同源性是很高的，那么这就很容易将植物不同基因组之间的单个碱基的不同当成突变体。
总之，目前，TILLING技术是一项新发展起来的技术，并且在许多生物里已经应用成功了。作为一种反向遗传学技术，既具有强烈的生命力和应用价值，同时本身也具有很多缺点。
３．TILLING技术应用展望
TILLING技术已经很成功的应用于多种生物突变体库的建立，同时还有许多生物正在应用该技术建立突变体库。但是，利用这些突变体所进行的后期研究却很少，一般也仅仅是验证该技术所筛选的突变体的准确性上。从目前来看，TILLING技术将会应用于以下几个领域的研究。
首先，应用TILLING技术创建人工突变体，或者利用该技术寻找自然变异。然后，再从功能上去验证这些在单碱基不同上的基因所产生的性状的改变，经过再进一步在蛋白质水平上阐明为什么单碱基的突变会产生基因功能上的不同，然后利用这些产生功能变异的基因。其次，利用模式生物已知的功能的基因，设计引物筛选其它构建的突变体库，如利用拟南芥已知功能基因序列扩增油菜突变体，筛选出相关同源基因产生的突变体，然后再从功能上研究这些基因的变异，并利用这些变异。第三，还可以利用该技术在自然群体中寻找ＳＮＰ标记，然后利用这些标记整合遗传图谱和分子辅助育种。
注; 本文作者从事应用TILLING技术构建油菜突变体库的工作，目前处于筛选阶段提取ＤＮＡ阶段和前期初步筛选阶段，现在主要的困难是ＤＮＡ提取，群体太大， TILLING技术对ＤＮＡ量要求很高，小样法无法达到要求，大样法提取上万分几乎不可能。拿到国外去自动化提取样品无法带过去，愿好心人提供帮助，愿意合作。同时愿意和我交流者也可以和我联系。本人就读于作物遗传改良国家重点实验室 E－MAIL:saddy@webmail.hzau.edu.cn
对该技术讨论得不是很多，从目前形势看TILLING 技术技术将会广泛应用。
于是就自己所了解的东西写出来供大家研究，同时也希望有兴趣者和我
交流
希望加分
TILLING 技术原理及其在植物功能基因组中应用进展
TILLING， 即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向诱导基因组局部突变技术)，是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikof领导的研究小组发展起来的，是一种全新的反向遗传学研究方法。主要的技术论文先后发表在Plant Physiology、Nature Biotechnology 、Genome Research 等学术刊物上。TILLING已成为自动化反向遗传学解决方案的关键词，以美国为首的北美实验室借助高通量的TILLING技术，启动了拟南芥TILLING项目(Arabidopsis TILLING Project)，获得美国国家科学基金会植物基因组计划(Plant Genome Re—searchProgram，PGRP)大力资助，在ATP项目组内部已经实现了材料、DNA样品及突变信息的充分共享，该项目在立项的第一年里就为拟南芥研究者们提供了超过100个基因上的l000多个突变位点。从最近研究来看，TILLING技术仍在应用于初步阶段，多半应用于突变体的构建。而体变体的利用和大范围基因功能筛选目前还处于初步摸索阶段。从最近几次国际性的基因组大会和相关文献上看，TILLING技术已经应用于除拟南芥之外的多数农作物上，另外在动物上如线虫，斑马鱼都已经利用TILLING技术构建了突变体库。但做的比较前沿的都是在农作物，其中，小麦，豆科模式植物，马铃薯等植物已经做出了初步成果。目前在国内已有几家单位应用TILLING技术做功能基因组研究。主要有上海植生所得白菜，华中农大国家遗传改良实验室的甘蓝型油菜和水稻等。本文就TILLING技术原理及其应用现状作一介绍。
1． TILLING技术路线
TILLING技术是基于人为的化学诱变产生突变位点，然后将这些突变位点转化为可以遗传的位点，最终利用检测突变位点
的技术筛选出带有突变位点的个体，从而达到可以利用这些突变位点分析基因功能的目的。
1.1诱变产生突变位点
就目前来看，诱变是产生突变的最主要方式。而针对TILLING而言所采用的是化学诱变，目前从研究上看一般采用EMS或ENU突变剂。多半采用EMS突变，因为TILLING技术所主要针对的是SNP突变位点，而EMS是单碱基突变剂。从诱变材料看，诱变多半是对植物的种子进行浸泡突变。也有少数是对花粉进行诱变，然后再利用小孢子培养技术将这些被诱变了的花粉粒培养成植株再经过染色体加倍技术纯合突变位点形成突变体库。这在玉米里已经应用成功，这种技术难度较高，要有很好的小孢子培养技术，同时经过诱变了的小孢子在培养成植株过程中难度很大。所以目前一般采用诱变种子的办法。在诱变时最重要的就是诱变剂的浓度，浓度太低要达到构建突变体库的目的需要的群体就大，筛选工作量加大，浓度高，群体会小，工作量大范围变小，但是高浓度的诱变会给植株生长带来很大的影响。会造成不育，或者诱变致死，因此一定要掌握好突变剂浓度。从目前来看，诱变剂（针对EMS）浓度在0.3%-1.5%之间。一般而言，在诱变后成活率达到10%，不育率在50%左右为最理想浓度
1.2可遗传的突变位点传代形成突变体库
由于TILIING技术多半采用的是诱变种子。而种子是一个多细胞体系，从植物发育的角度讲，只有在位于胚胎的顶端分生组织的能发育成生殖组织的细胞里的基因发生突变才能遗传到下一代，因此，由突变的种子产生的M1代植株是嵌合体，不能作为突变体库材料，必须经过纯合一代才能形成突变体库。因此，目前所采取的大多数方案是，M1植株套袋自交，产生M2 种子，M2植株长成后所包含的突变位点都能在突变体库里被我们利用。一般而言，一个可以产生下一代的M1植株产生4-200个M2 植株，这些M2植株从遗传背景上说多半是含有不同的突变位点的。此时，就可以提取M2植株的DNA作遗传分析，筛选突变位点。同时每个M2 植株自交形成M3 种子，该M3种子形成突变种子库，这些来自于不同M2单株的M3种子要和DNA库一一对应，以便在DNA水平上筛选出突变位点与表型对应分析。
1.3突变位点的筛选
从M2 植株中提取得DNA是含有单碱基突变位点。TILLING技术所采用的检测这些SNP的方案是利用这些含有不同突变位点的M2 DNA形成一个POOL，一般是4-16个M2 混合成一个POOL，视材料而定。然后经过聚合酶链式反应扩增出想要研究的基因片断，这些DNA片断经过变性、退火后就会形成一些不匹配的DNA双链，而S1酶（如CEL1）又能识别这些不匹配的双链进行切割，再进行变性后，在所在的POOL中就会出现一些分子量变小的DNA片断，而这些片断本身是经过荧光标记的，因此经过检测就知道该DNA POOL中含有突变体。然后对具有突变位点得POOL进行单个M2 检测突变位点，见下图。
1.4 TILLING引物的设计
在筛选突变位点时，形成DNA池后是要对感兴趣的基因或序列进行PCR扩增。而对感兴趣的基因或序列进行扩增的关键是如何设计好高效引物。EMS是针对G/C突变为A/T的，因此在G/C含量高的区域必定突变频率高。所以，TILLING引物设计上就要根据这一点设计。目前，基本上都是应用CODDLE来设计引物，它是是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikof领导的研究小组设计的专门针对TILLING引物设计的网上引物设计软件，它基本原理是根据已知序列信息，包括序列、编码序列等信息，找出G/C含量最高的外显子区域，然后再基于Primer3设计引物。TILLING引物设计的前提条件是要知道自己想研究基因的序列信息。
2．TILLING技术评价
TILLING技术的关键在于LI-COR公司开发的双色荧光标记（７００nm和８００nm）和能识别该荧光的激光头。利用该荧光标记引物能够使扩增产物被识别，从而达到筛选的目的。而TILLING技术创新性在于能高通量检验单碱基突变。从该技术出现以前，ＳＮＰ是很难检测到的。但是TILLING技术利用了带有ＳＮＰ的ＤＮＡ片断形成的不匹配的ＤＮＡ双链的性质，结合单链核酸酶的切割不匹配区域，然后利用ＤＮＡ片断变短筛选的方法筛选到带有ＳＮＰ的ＤＮＡ片断。同时还利用形成ＤＮＡ池的这种做法大大提高筛选速度，从而达到完全的高通量。
但是，该技术也有其不可忽视的缺点。利用该技术进行反向遗传学研究的前提条件是要知道所研究基因的序列，这在目前来说对许多植物而言是做不到的。其次，在多倍体植物里面，如甘蓝型油菜，小麦等植物，本身就是多基因组，那么不同基因组之间一般同源性是很高的，那么这就很容易将植物不同基因组之间的单个碱基的不同当成突变体。
总之，目前，TILLING技术是一项新发展起来的技术，并且在许多生物里已经应用成功了。作为一种反向遗传学技术，既具有强烈的生命力和应用价值，同时本身也具有很多缺点。
３．TILLING技术应用展望
TILLING技术已经很成功的应用于多种生物突变体库的建立，同时还有许多生物正在应用该技术建立突变体库。但是，利用这些突变体所进行的后期研究却很少，一般也仅仅是验证该技术所筛选的突变体的准确性上。从目前来看，TILLING技术将会应用于以下几个领域的研究。
首先，应用TILLING技术创建人工突变体，或者利用该技术寻找自然变异。然后，再从功能上去验证这些在单碱基不同上的基因所产生的性状的改变，经过再进一步在蛋白质水平上阐明为什么单碱基的突变会产生基因功能上的不同，然后利用这些产生功能变异的基因。其次，利用模式生物已知的功能的基因，设计引物筛选其它构建的突变体库，如利用拟南芥已知功能基因序列扩增油菜突变体，筛选出相关同源基因产生的突变体，然后再从功能上研究这些基因的变异，并利用这些变异。第三，还可以利用该技术在自然群体中寻找ＳＮＰ标记，然后利用这些标记整合遗传图谱和分子辅助育种。
注; 本文作者从事应用TILLING技术构建油菜突变体库的工作，目前处于筛选阶段提取ＤＮＡ阶段和前期初步筛选阶段，现在主要的困难是ＤＮＡ提取，群体太大， TILLING技术对ＤＮＡ量要求很高，小样法无法达到要求，大样法提取上万分几乎不可能。拿到国外去自动化提取样品无法带过去，愿好心人提供帮助，愿意合作。同时愿意和我交流者也可以和我联系。本人就读于作物遗传改良国家重点实验室 E－MAIL:saddy@webmail.hzau.edu.cn
