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应用直接标记 DNA 比较基因组杂交

最新修订时间：

原理

材料与仪器

荧光素标记的待测探针 DNA 德克萨斯红标记的参照 DNA
乙酸钠 乙醇 主要的杂交溶液 正常人染色体铺片 变性液 蛋白酶 K 溶液 杂交片洗液 2 X SSC PN 缓冲液 DAPI 的抗淬灭溶液
玻璃刀 水浴箱 玻片加热器 橡皮胶带 湿盒

步骤

1. 取 1.5m l 微量离心管： IOjJ 2(Vg/ml荧光素标记的待测探针D N A ; IOjul 2(Vg/ml 德克萨斯红标记的参照探针D N A ; 20pl ljug/jul人 Cot-1 D N A 。 2 . 加入1/10体积的3111〇1/1乙酸钠， 9«^.2混 合 ， 2.5体积的无水乙醇沉淀， 4。 〇最大 转速离心30m i n ，如结果杂交信号过弱，可增加待测和参照D N A 的量。 3. 去除上清液，吸干管壁上多余的液体，小心避免触及沉淀物。空气干燥lOmin。 4•加入IOjul主要杂交溶液，用移液器小心将沉淀混勻，振荡，最大转速离心IOs使液 体在管底，室温下溶解沉淀物，执行第5〜9 步。 5•在染色体铺片背面用钻石笔将相应区域标记出，如需要，通过呼气使染色体区域更 清楚可见。 6 . 预热变性液至73°C ，将 Coplin缸置于75°C 水 浴 箱 中 （ 检查缸内的温度） 。在 37° C 玻 片预热器上至少2 m i n ， 将 铺 片 （ 一次不得超过3 或 4 片）置 于 7 3 ° C 变性液中，孵育 2. 5 〜 I O m i n ， 确 定每一批铺片的最佳变性时 间 。 7•连续在室温下7〇%、 8 5 % 和 100%乙醇中脱水，每次2min，垂直在空气中干燥。 8 . 任意选择：室温下在蛋白酶K 中 5〜7m i n ，重 复 第 7 步。用较长时间降低背景并增
强探针的渗透。用较短时间（ 或完全跳过）保证染色体形态和带纹。 9•将铺片置于37°C玻片加热器。变性探针混合物7〇 。 〇 5min，随 后 （ 铺片仍在加热器 上）迅速将10/^1探针混合物加在铺片的染色体区域。用 18mm2的盖玻片覆盖，用镊 子轻压盖玻片去除气泡。用胶布将盖玻片边缘封闭。 10. 37°C湿盒杂交2〜3d (最好> 3 6 h ; 在杂交液未干燥时，杂交可以大于3d) 11•揭去胶布并小心除去盖玻片， 45°C ， 3 缸杂交洗液中各洗IOmin, 也可在揭去胶布 后 ，在第一次洗片时随盖玻片浸入洗液中。 12. 45°C 的 2X S S C 洗 lOmin，室温 2X S S C 洗 lOmin。 13. 室温下P N 缓冲液中洗两轮，各 洗 5min，室温下双蒸水洗两轮，洗 5mm。空气 干燥。 14. 力口8“ DAPI复染，盖上22mm2的盖玻片4°C保 存 2〜3 周。 1 5 . 检查并分析（ 基本方案2)。 备选方案应用间接标记 D N A 比较基因组杂交 间接标记探针的比较基因组杂交比应用直接标记的方法在荧光强度上能更广泛地显 示变异，二级检测需要附加的方案和试剂。然而这些缺点可以弥补直接偶联核苷酸昂贵 的价格。 附 加 材 料 （ 见基本方案1，标_7的条目参见附录1) ZOpg/m l生物素标记的待测组DNA (如全基因组肿瘤DNA; 支持方案3) 20； xg/m l地高辛标记的参照DNA (正常全基因组DNA; 支持方案3) 封闭溶液： 4 X S S C /1% ( m A O B S A V 检测溶液 V 4X S S C 4X S S C /0. 1% 〇/A 〇 TritonX-IOO 24m m X 50m m 盖玻片 1 . 准备探针混合物（ 基本方案1，第 1 步）将生物素标记的待测组DNA替代荧光素标 记 的 待 测 探 针DNA，地 高 辛 标 记 的 参 照 DNA替代德克萨斯红标记的参照探 针 DNA。 2 . 制备探针和分裂中期染色体，执 行 杂 交 （ 基本方案1，第^ 〜12步） 3 . 将玻片在封闭溶液中室温下孵育5min。 4 . 吸干玻片上多余的液体，但不能使玻片干脱水。加 IOOjal检测溶液在染色体区域， 将 24mmX 50mm盖玻片覆盖在载玻片上使它浮在液滴上，室温下孵育60min。 5 . 室温下在 4XSSC洗片 IOmin, 在 4 XSSC/0.1% (VAO TritonX-100 洗片 lOmin， 然后又在4XSSC洗 片 I O m ii最后将玻片浸在双蒸水5min，洗两轮，空气干燥。 6•复染并检测玻片（ 基本方案1，第 14和 15步） 。 支持方案1 比较基因组杂交中期染色体铺片的制备 最好应用来自男性捐献者制备的中期染色体铺片，与肿瘤或参照DNA的性别无
关。能很好地应用于着丝粒或特异序列探针的F I S H 的玻片可能并不适合于C G H 。如 果 C G H 应用常规方法制备的染色体铺片不能达到很好的效果（ 单 元 1)，尝试以下的 修改方案。 1. 在 P H A 作 用 （ 单元4.1，基本方案，第 3a 步）过程中，将孵育时间设为72h。 2. 为了达到同化目的（ 单元4.1，基本方案，第 4 步） ，在氨甲蝶呤添加后孵育17h。 180g 离心8m i n 以除去氨甲蝶呤（ 加入脱氧胸腺嘧啶苷前） ，去除介质，加 入 5ml HBSS。 重复一次去除HBSS。 在加入脱氧胸腺嘧啶苷后孵育5h。 3. 在秋水仙胺作用（ 单元4.1，基本方案，第 5 步）过程中，增加秋水仙胺的量使终浓 度为0. lMg/m l 并且设孵育时间为lOmin。 4 . 在低渗处理（ 单元4 1，基本方案，第 6 步）过程中，使用之前制备新鲜的75mmol/L KCl并孵育20min。 5. 在第一次固定（ 单元4.1，基本方案，第 7 步）过程中，在继续执行下一步前使沉淀 于 4°C 在固定剂中孵育30min。 6 . 固定过程（ 单元4.1，基本方案，第 10步） ，重复固定并离心4〜6 次。 7 . 在制备大批铺片之前首先要检查它的质量，将一滴悬液滴在乙醇清洁过的干净玻片 上，玻片至少要用不含棉绒的无尘纸擦拭过一次并平放在实验操作台上。在相差显 微镜下检查。制备较好的染色体铺片具有低细胞密度、较分散的中期相、几乎无细 胞质和碎屑。 8 . 当铺片制备（ 单元4.1，支持方案）完成后，执行C G H 实验前， 一 20°C 液氮密闭罐 中至少保存2〜3 周。 9. 应用蛋白酶K 处理的或不用蛋白酶K 处理的铺片执行标准的C G H 实验并检测，以 确定最佳的变性时间和蛋白酶K 处理时间。 支持方案2 用于CGH的基因组DNA的制备 对于成功的C G H 实验，来自健康捐献者的和来自被研究的肿瘤组织的髙分子质量的 基因组D N A 是必备的。待测的和参照的D N A 必须与捐献者的性别相匹配，而不需要来 自同一个患者。参照D N A 来源于血液（ 附录3A ，单 元 10. 3 ) 或哺乳动物组织（C P M B 单元2. 2)。 待 测 （ 肿瘤）D N A 来源于临床标本（ 单元10. 4 ) 或细胞系（ 附录3A )。 对于C G H 实验， D N A 的纯化不像其他实验一样重要，但要尽量避免使用降解的 D N A ，因为这会使得N I C K 平移后的探针片段太小。 当评价用C G H 分析的肿瘤样本时，非常关键的是肿瘤标本中必须含有大于或等于 5 0 % 的肿瘤细胞。可以通过苏木素或伊红染色检测肿瘤组织冰冻切片，确定含有肿瘤组 织的区域，并将正常组织切除来增加肿瘤样本中胂瘤细胞的数量。 支持方案3 用于CGH的标记DNA探针的制备 材料 V 1〇 X 核苷酸混合物 用于参照D N A 标记的d U T P : l^g/rnl德克萨斯红-5-dUTP (直接标记； DuPont
NEN) 或地局半-11-dUTP (间接标记； Boehringer Mannheim) 用于待测（ 肿瘤）D N A 标记的d U T P : lpg/m l 荧光素-12-dU T P (直接标记； Du Pont N E N ) 用于待测（ 肿瘤）D N A 标记的d A T P : 生物素-14-dATP (间接标记）在 BioNick IOXdNTP 混合物中（Life Technologies) 待 测 （ 肿瘤）和 正常（ 参照）基因组D N A (支持方案2) 5〜IO^xl D N A 聚合酶 I (Life Technologies) BioNick 10X 酶混合物（Life Technologies) I% 琼脂糖胶 15〜70°C 水浴箱 la. 应用耦合的d U T P 标记：按以下顺序在置于冰上的〇.5m l 微离心管中加入Nick平 移试剂： 5M110X 核苷酸混合物； Ijul用于待测和参照D N A 标记的dUTP (终浓度为InmoD ; Iyg待测或参照D N A ; 加入水使终体积为5〇4; Ipl 5〜10U/V1 DNA聚合酶工（ 终浓度0.1〜0. 2U/ /xl) 。 34 BioNick 10X 酶混合物（ 依照D N A 质量和反应后片段大小调整用量） 。 lb. 应用生物素-14_d A T P 标记：按照第Ia步中准备反应，用 5/J 含生物素-14-dATP 的 BioNick I O X d N T P 混合物取代核苷酸混合物，删去用于标记的d U T P 。 2•充分混合，短暂离心， 15°C反应45〜90min (依靠D N A 质量优化反应时间，一般用 60min)。 3. 70°C 加热IOmin停止反应，取 7^1反应混合物非变性1 % 琼脂糖胶电泳， E B 染色， U V 观察并估计片段长度（ 最佳长度为300〜3kb)。

来源：丁香实验

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