基因组DNA Southern杂交

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1）基因组 DNA Southern印迹的制备
预备
1．用适当的限制性内切酶消化基因组 DNA样品（10μg）。

2．进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20×25cm）。常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的λDNA、Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA和100或1000bp的梯形图谱 。电泳完毕，将凝胶放在紫外透射仪上，并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时，小心不要将凝胶滑落或弄破。

Southern印迹的制备

1．将凝胶转移至塑料盒内。

2．加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤，置室温摇床温育15min。这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色，如果15min后仍呈蓝色，应再温育5min。

3．小心地塑料盒内HCl弃去，用蒸馏水漂洗凝胶一次。

4．加入至少4倍体积的变性缓冲液，置室温摇床温育20min。

5．用新鲜缓冲液重复步骤4，小心弃去变性缓冲液，用蒸馏水稍加漂洗。

6．加入至少4倍体积的中和反应缓冲液，置室温摇床温育15min。

7．用新鲜缓冲液重复步骤6。

8．当处理凝胶时，裁一张略大于凝胶的滤膜（硝酸纤维膜或尼龙膜），预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少15min。

9．安装转移装置。在盘中加入印迹缓冲液（20×SSC），在缓冲液面作一平台，比如可倒置一凝胶盘，上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸（Whatman 3MM），平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡，并将滤纸推平。

10． 倒数毫升20×SSC于滤纸表面，将凝胶面向下倒扣在滤纸上，小心赶出凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中（虹吸短路）。

11． 加数ml 20×SSC浸没凝胶，表面覆以滤膜，确保凝胶与滤膜之间无气泡。

12． 裁三张大小合适的3MM滤纸，用20×SSC浸湿后铺在滤膜表面。

13． 放一叠干燥的吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸上（约5～8cm高）。

14． 置一玻璃板于吸水纸上，其上放一重约0.75～1kg的物体。

15． DNA转移可进行12～16h（如过夜），确保槽内有足够的20×SSC（1～3L）。