基本方案2 显微镜检查法、成像、用于 CGH 的图像分析

直接的视觉观察被用于 CGH 杂交的初期评价并且能提供染色体改变的初步解释，应用装配有相应激发光源、滤片、63X 或 100X 油镜镜头的荧光显微镜观察 CGH 杂交的中期分裂相。DNA 序列拷贝数的改变决定于每一条染色体上相应红/绿荧光强度的改变。两种相关突光强度的差别能通过双通道滤片与复染的 DAPI 同时被传送红绿荧光。染色体上大片段的缺失将显现红色，而大片段的扩增则显现为绿色。较小的明亮绿色荧光区域在基因扩增大于 5?7fdd 时能被检测到。在相对拷贝数正常的染色体区域将出现黄或橙的颜色。小区域的扩增或缺失（<10~20Mb) 人的肉眼无法直接观测到。这些改变更依赖于对荧光强度比值的测量，而这只能通过数字影像分析。高质量的 CGH 显示较好的 DAPI 带纹，延染色体均匀分布的红绿荧光，并且仅有最小的背景染色。

高分辨的量的信息来源于数字影像。因为 CGH 分析是一个相对较新的技术，很多成功的 CGH 分析系统在实验室里已取得了一定的发展。仅有很少的公司（ApUiedImaging、MetaSystems、OncorImageSystems、 Vysis) 生产了应用于商业的系统，并且声称该系统能够进行 CGH 分析。这些系统混合着巨大的变化，并且经历着演变，因此在购买这些系统时要确定它是否具有所需要的功能。

对于每一次实验，选择 3~5 个中期相。

1.最佳的分裂相染色体几乎无严重的弯曲，无接触，无重叠；

2.最少的背景染色；

3.相对平滑，无颗粒状；

4.每一分裂相中最少的染色体交叉浓缩改变。

CGH 的特异性依赖于反转杂交所有改变的确定（如用反转标记的探针重复杂交）。

当绿红比值与标准的和反转杂交的比较时，拷贝数的改变将是相反的方向。正常的杂交将被作为每一个样本的对照，着丝粒和异染色质区与着丝粒周围短臂区，被排 除在外，不能用 CGH 结果解释，必须注意 GC 含量丰富的 1 号短臂、19 和 22 号染色体。这三条染色体区域同所有染色体着丝粒和异染色质区，它们给出错误的比值改变如果杂交条件不够优化时。来自每一染色体至少 4 个拷贝的数据能被分析。对关于影像分析和数据解释的变动方面的后续讨论，见 CPHG 单元 4.6。