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    应用抑制性消减杂交检测环境样品中 元基因组多样性实验

    相关实验：应用抑制性消减杂交检测环境样品中 元基因组多样性实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    2 . 1 从环境样品中提取总基因组DNA 1 . 磷酸盐缓冲液 0. I mol/L , p H 8. 0 : 把 5. 3 m L A 液 [27. 6 g N a H P O 4 • H 20 / L (0. 2moI ’ L ) ] 和 94. 7 m L B 液 [53. 65g N a 2H P 0 4 . 7H 2O /L (0. 2m o l /L ) ] 混 合 ，并 用 H 2O 定 容 到 200 m L 。 2 . 裂 解 液 ： 0.15 mol/L N a C l, 0. I mol/L E D T A ， p H 8. 0。高温灭菌后加人 15 m g /m L 溶菌酶溶液，贮存于4°C 。 ’ 3. S D S 溶液： Q.I m 〇I/L N a C l, 0• 寥mol/L T r b -H C l , p H 8. 0, l O H 十 ^鑛 基 疏 酸钠。 4 . 蛋白酶 K (Sigma-Aldrich)。 5 . 缓冲苯酸， p H 8 . 0 , 忙 存 于 4°C 棕色玻璃瓶。 6•苯酚：氯 仿 ：异 戊 醇 （25 : 24 : 1)。 7 . 氯 仿 ：异 戊 醇 （24 : 1)。 8 . 乙酸铵10. 5 mol/L : 每 100 m L d d H 20 溶 解 80. 93 g 乙酸铵。 0. 22 孔径滤 膜过滤灭菌。 9 . 冷 的 异 丙 醇 （4°C )。 10. 7 0 % 乙醇。 11. T E 缓冲液， p H 8.0: l O m m o l /LTris-H C l ， p H 8.0， l m m o l /L E D T A ， p H 8.0。 12_ RNase O n e IM核糖核酸酶（ Promega)。 JC存于一20°C 。 2 . 2 抑制消减杂交法（ SSH) 消减杂交法用C L O N T E C H P C R -Select™ 细菌基因组 消 减 试 剂 盒 （Clontech La b oratories Inc.， cat. no. 637404)。 下列材料是由试剂盒提供的。 4 X 杂交缓冲液在室温 下贮存。其他试剂都贮存于一20°C 。 2.2. 1 核 酸 内 切 酶 消 化 1. 10X i?saI 限制缓冲液： 100mmol/Lbis-tris-propan^HCl (2 ， 3-丙 烷 盐 酸 ） ， pH 7. 0， 100 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L 二 硫 苏 糖 醇 （ DTT)。 2. 12 I (10 U V L )。 2 . 2 . 2 接 头 连 接 1. 21 pL T4 DNA 连 接 酶 （ 400 U /ML ; 含有 3 mmol/L ATP)。 2. 5XDNA 连接缓冲液： 250 m m o lT ris -H C l， 50 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L DTT， 0.25 mg/mL 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA)。
    3. 30 fxL接头 1(10 mmol/L)。 4. 30 接头 2R(10 mmol/L)。 2. 2. 3 杂交 1. 4 X 杂 交 缓 冲 液 ： 200 mmol/LN-2-羟乙基哌嗪-JV'-2-乙 磺 酸 （ H E P E S ~H C 1)， p H 8. 0 ， 2 mol/L NaCl， 0• 8 mmol/L E D T A , p H 8. 0。室温贮存。 2 . 稀释缓冲液 ： 20 mmol/L HEPES~HC1， pH 8. 3， 50 mmol/L NaCl， 0. 2 mmol/ L EDTA, pH 8 .0 。 2. 2. 4 P C R 扩增 1. 50 p L P C R 引物 I (10 m m o l /L )。 2. 100 巢式引物 I (10 m m o l /L )。 3. 100 巢 式引物 2R (10 m m o l /L )。 4. 10 pf P C R 对照消减 c D N A 。 2.2. 5 对 照 试 剂 I. 5 大肠杆菌基因组D N A (I m g /m L )。 2•l O ^ x L D N A 对 照 （3 ng/fx L ; 0X 174/f^此^I消化） 。 3. 50 p L 10 fxmol/L 23S R N A 正 向引物_。 4. 50 (uL 10 fxmol/L 23S R N A 反 向引物_。 2 . 3 克隆和文库测序 这 个 过 程 利 用 T O P O T A 克 隆 测 序 试 剂 盒 （ 含 P C R ® 4-T O P O ® 载 体 ）与 O n e Shot® T O P l O Electrocomp™ £. coZi (Invitrogen 公 司 ， cat. no. K 4580-01)。下列材料 由试剂盒提供。除非特别说明，所有试剂都C 存在一20°C 。 2. 3.1 T O P O T A 克 隆 测 序 试 剂 盒 （ 含 P C R ®4-T O P O ® 载 体 ） 1. 25 p L p C R ®4-T O P O ® [ 5 0 % 甘 油中含 10 ng / p L 质 粒 D N A ， 5 0 m m o l /L T r i s - H C 1, p H 7.4(25〇 C ), I m m o l / L E D T A , 2 m m o l / L D T T , 0. I% Triton X -100, lOOfxg/m L B S A , 30/imol/L 酸红]。 2. 100 p L I O X P C R 缓 冲 液 [100 m m o l / L Tris-HCU p H 8. 3(42。 0 , 500 m m o l / L K C l , 25 m m o l / L M g C l 2, 0. 0 1 % 明胶]。 3. 10 /uL d N T P 混合 液 （12_ 5 m m o l / L d A T P ， 12. 5 m m o l / L d C T P ， 12. 5 m m o l / L d G T P ， 12. 5 m m o l /L d T T P , 水中中和 p H 至 8. 0)。 4. 5 0 p L 盐 溶 液 （ I.2 m o l / L N a C l , 0 •06 m o l / L M g C l 2)。 5. I m L 无菌水。 6. 2 0 fxLM13 正 向 （ 一 20)弓丨物[0_lfxg/ML， TE缓冲液， pH 8. 0(407 pmol)]„ 7. 20 M L M 13 反 向 引 物 [0.1 / xg/fxL， T E 缓冲液， p H 8.0(385 pm o l)]。
    8. 20 M L T 3 引 物 [0.1 吨 /必 ， T E 缓冲液， p H 8. 0(329 pmol)]。 9. 2 0 M L T 7 引 物 [O.lfxg/p L ， T E 缓冲液， P H 8.0(328 pmol)]。 10. IOpL 对照 PCR 模 板 （0.1 网/y L ， TE 缓冲液， pH 8.0)。 11. 10；丄 对 照 PCR引 物 （ 各 0.1哗/fJL溶 于 T E 缓冲液， pH 8.0)。 M 13 正 向 引 物 （ 一20) 5，-G T A A A A C G A C G G C C A 0 3 ， M l 3 反向引物 5，-C A G G A A A C A G C T A T G A C -3， T 3 5，-A T T A A C C C T A C T A A A G G G A -3, T 7 5，-T A A T A C G A C T C A C T A T A G G 0 3 ， 2. 3. 2 One Shot® TOPlO Electrocomp™ 大 肠 杆 菌 及 试 剂 1. S .O .C . 培 养 基 [ 2 % 姨 蛋 白 陈 ， 0 . 5 % 酵 母 提 取 物 ， 10 m m o l / L N a C l ， 2. 5 m m o l / L K C 1， 10 m m o l / L M g C l 2， 10 m m o l / L M g S O 4， 20m m o ] / L 葡萄糖 (6m L )]。 IC存 于 4°C 或室温。 2. 21X 50 jaL T O P l O 细胞 Electrocomp™ 。贮存于一80°C 。 3. 50 juL p U C 19 D N A 对 照 （10 p g / p L 在 5 m m o l / L Tris-H C l ， 0. 5 m m o l / L E D T A ， p H 8.0中 ） 。贮存于一80°C 。 2. 3. 3 其 他 辅 助 材 料 和 试 剂 1. A Z m I 限 制 性 内 切 酶 （ 包括来自 N e w England Biolabs 的 NEBuffer2)。 2. I kb D N A 分子质量 标 准 （ Invitrogen)。 3. I.5m L 管 （Fisher Scientific桂化处理或低保留微量离心机管） 。 4. 0. 2m L 薄壁的 P C R 反 应 管 （Fisher Scientific Costar P C R 导管） 。 5 . 无菌去离子水。 6.5父丁8£电泳缓冲液：溶 解 546 1 ^ 碱 ， 27.56 硼酸， 20 11^0.5111〇 1/1^〇丁八 在 I L 双蒸水中， p H 8. 0。琼脂糖凝胶电泳工作液是0. 5 X (45 m m o l /L Tris-硼 酸盐， I m m o l / L E D T A h 7. 0. 2 m o l / L E D T A , p H 8. 0。 8• 酚 ：氯 仿 ：异 戊 醇 （25 : 24 : I)(Sigma-Aldrich)。 9 . 氯 仿 ：异 戊 醇 （24 : I)(Fluka via Sigma-Aldrich)。 10. 3 m o l / L 乙酸钠， p H 5.2。 11. 20 m g / m L 糖 原 （ Sigma-Aldrich)。 12. 1 0 0 % 冰乙醇。 13. 8 0 % 冰乙醇。 14. T a K a R a E x T 叫 D N A 聚 合 酶 （ 包括 d N T P s 和缓冲液X R s h e r Scientific)。 15•电穿孔试管 0 •I c m (Bio-R a d )。 16. L B 琼 脂 平 板 （1 . 0 % 胰 蛋 白 胨 ， 0 . 5 % 酵 母 提 取 液 ， 1.0% N a C l ， p H 7.0, 1. 5 % 琼脂） ，加人氨苄西林， （50〜100 fxg/m L )。 17. L B (Luria-Bertani) 培 养 基 （1 . 0 % 胰蛋白胨， 0 . 5 % 酵母提取液， 1.0% N a C l , p H 7.0)
    18. 9 6 孔细胞培养板，平底，带有低蒸发盖（Corning)。 1 9 . 甘 油 。 2. 4 通过斑点印迹和southern印迹来确认Tester特异D N A 片段 2. 4 . 1 斑 点 印 迹 膜 的 制 备 1 . 快 速 Q I A P C R 提 纯 试 剂 盒 （ Q I A G E N )。 - 2. 无菌双蒸水。 3. W h a t m a n 3 M M 滤纸。 4. I mol/L N a O H 。 5. 0. 4 mol/L N a O H 。 6. 200 m m o l / L E D T A ， p H 8. 2。 7. H y b o n d N + 尼 龙 膜 （ A m e r s h a m )。 8. 斑点杂交歧管，如 Bio-Dot微 量 过 滤 装 置 （ Bio-Rad)。 9 . 干净的玻璃托盘。 10. 2 X S S C 。 11. 紫外透明的塑料薄膜。 2. 4. 2 Southern印 迹 膜 的 制 备 1. QIAquick P C R 提 纯 试 剂 盒 （ Q I A G E N )。 2. 无菌双蒸水。 3. W h a t m a n 3 M M 滤纸。 4. 琼脂糖和溴化乙锭染色。 5. 0. 25 m o l / L H C l 0 6 . 变性溶液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。贮存于室温。 7. 中和溶液： I. 5 mol/L NaCl, 0• 5 mol/L Tris-Cl， pH 7. 0。贮存于室温。 8 . 干净的玻璃托盘2 个。 9. 20X S S C : 3 mol/L N a C U 0 •3mol/L N a 3Citrate • 2H 20 ，用 I m 〇l/L H C l 调节 pH 至 7.0, 存于室温。 10. 2X S S C 。贮存于室温。 2. 4. 3 用 于 斑 点 印 迹 和 Southern印 迹 的 放 射 性 标 记 DNA 探 针 1 . 无 菌 双 蒸 水 。 2• 随 机 引 物 D N A 标 记 系 统 （ I n v itr o g e n ) 提 供 的 材 料 ： d A T P 溶 液 ， d G T P 溶 液 ， d T T P 溶 液 ，随 机 引 物 混 合 缓 冲 液 ， K le n o w 片 段 ，终 止 （ 缓 冲 ）液 ，贮 存 于 一20。。。 3. [ 〇r 32] d C T P , 3000 C i/m m o l， lO p C i/fx L • 贮存于一2〇°C。 2 . 4 . 4 放 射 标 记 D N A 探 针 的 提 纯 I. N ensorb™ 20 核 酸 纯 化 柱 （ N E N L ife Science P ro d u cts, B oston, M A )。 . 232 •
    2•—次 性 5 m L 注射器。 3. 1 0 0 % 甲醇。 4•试剂 A : 0. I m o l / L Tris-H C l ， 10 mmol,，L 三 乙 胺 （ T E A ) ， I m m o l ，L E D T A 二钟盐或二钠盐， p H 7.7, C ：存 于 4°C ，保质期一个月。 5. 5 0 % 甲醇。 6 . 分子生物学等级水。 7. 1.5m L 微量离心管。 2. 4. 5 斑 点 印 迹 和 Southern印 迹 膜 与 放 射 性 DN A 探 针 的 杂 交 1. 杂交瓶。 2. PerfectHyb Plus 杂 交 缓 冲 液 （ Sigma-Aldrich)。 3 . 低严紧度洗液： 2 X S S C ， 0 . 1 % S D S 。贮存于室温。 4 . 中严紧度洗液： 0.2X S S C , 0.1%’S D S 。 JC存于室温。 5. 2 X S S C 。 6 . 磷 屏 或 X 光片。 7 . 磷屏成像系统，如 B A S ~1800 II(Fujifilm) 或 X 光片机。 2. 4. 6 斑 点 印 迹 和 Southern印 迹 膜 的 洗 脱 1. 0 . 1 % S D S 。 2 . 玻璃皿。 2 . 5 总 RNA的提取和16S rRNA斑点印迹 2. 5.1 总 R N A 的 提 取 1. 0 •l m 〇l/L 磷酸钠缓冲液， p H 6. 0 : 混合 87. 7 m L 溶液 A [27. 6 g N a H P O 4 . H 2O /L (0. 2 mol/L ) ] 和 12.3 m L 溶 液 B [53.65 g N a 2 H P O 4 •7H 2 0 , ’L (0.2m o l Z L )]，再加水定容到200 m L 。 2 . 乙 酸 缓 冲 液 ， 卩 1 1 5 . 1 ( 5 〇 1 1 1 1 1 1 〇 1 / 1 乙 酸 納 ， 1 0 . 1 ：1 1 1 1 〇 1 / 1 ^ 0 丁 八 ) 。 3. 20 % S D S C W /V )。 4 . 苯酚 ， p H 5.1，棕色玻璃瓶4°C 保存。 5. 0.1 m m 错珠，高温灭菌。 6. 2m L 微量离心管。 7 . 苯 酚 ：氯 仿 ：异 戊 醇 （25 : 24 •• 1)。 8 . 氯 仿 ：异 戊 醇 （24 : 1)。 9. 3 m o l/L 乙酸钠。 10. 无水乙醇。 11. 8 0 % 乙醇。 12. 无 R N a s e 水 。 13. R Q l 无 R N a s e D N a s e (P r o mega)。
    14.琼脂糖和溴化乙锭染色。 2. 5. 2 作 为 R N A 斑 点 印 迹 的 DNA 探 针 放 射 性 标 记 1•多核苷酸激酶（polynucleotide kinase， Invitrogen)。 2. I O X 激酶缓 冲 液 （ Invitrogen)。 3. O 32P ]A T P 。 4. 1 % I G E P A L C A -630(Sigma-Aldrich)。 5•无 R N a s e 水 。 6. NensorbTM20 核酸纯化柱（N E N L i f e Science Products， Boston, M A )。 7. —次 性 5 m L 注射器。 8. 1 0 0 % 甲醇。 9 . 试剂 A : 0 .1 m o l/L T ris-H C l， 10 m m o l/L 三 乙 胺 （ T E A ) , l m m 〇l/L 二钾或 二 钠 E D T A ， pH 7. 7 。在 4°C下可保存一个月。 10. 5 0 % 甲醇。 11. 1.5m L 微量离心管。 2. 5. 3 R N A 斑 点 印 迹 膜 的 制 备 及 其 与 放 射 性 标 记 DNA 探 针 的 杂 交 1. 2 % 戊 二 醛 。 2. H y b o n d N + 尼 龙 膜 （ A m e r s h a m )。 3. W h a t m a n 3 M M 滤纸。 4 . 斑点印迹歧管，如 Bio-D o t 微 量 过 滤 法 仪 器 （ Bio-R a d )。 5 . 干净的玻璃托盘。 6•无 R N a s e 水 。 7 . 紫外透明塑料薄膜。 8 . 杂交瓶。 9. PerfectHyb Plus 杂 交 缓 冲 液 （ Sigma-Aldrich)。 10. R N A 斑 点 印 迹 法 洗 液 （1X S S C ， 1 % S D S )。 11. 磷 屏 或 X 光片。 1 2 . 磷屏成像系统如B A ^180〇 n (Fujifilm) 或 X 光片机。 13. ImageQuant(Fujifilm) 或其他密度测定软件。 3.方法 3 . 1 从环境样品中提取总基因组DNA 这个过程改良自从沉积物中提取D N A 的 方 法 （49)，并被优化用于瘤胃样本。 D N A 分离前，新鲜的瘤胃样本可以通过两层粗棉布过滤大颗粒物。其他环境样品可选 用相应的D N A 分离方法。 1•清洗样品：混合2 g 环境样品和I O m L O .lmol/L 磷酸钠缓冲液， PH 8.0 , 振荡 片刻。样本在4°C 6000 g 离 心 10 m i n，摒弃上清液。
    2•样本悬浮于10 m L p H 8. O 磷酸钠缓冲液，并重复步骤1。 3•每克样本沉淀加人2 m L 裂解液， 37°C 轻轻摇动30 min (摇 床 上 75 r/m i n )。 4•加入同体积S D S 溶液到样本中， 37°C 轻轻摇动30 min (摇 床 上 75 r/niin)。 5. — 室温反复冻融3 次 。 6 . 加蛋白酶K ，终 浓 度 5 0 阳 /m L ， 37°C 孵 育 30 m i n 。 7 . 加等体积苯酚，轻轻上下倒置样品管4 m i n 。 4°C ， 10 000 g 离 心 30 m i n 。用移 液器把上清液移到干净的管内。 8•加等体积酚：氯 仿 ：异戊醇，轻轻上下倒置样品管4 m i n 。 4°C , 10 000 g 离心 30 m i n 。用移液器把上清液移到干净的管内。 9 . 加等体积氯仿，轻轻上下倒置样品管4 m i n 。 4°C ， 10 O O O g 离 心 15 m i n 。用移 液器把上清液移到干净的管内。 10. 加 10. 5 mol/L 乙酸铵到样品中，其 终 浓 度 为 2. 5m 〇I/L 。加等体积冰异丙醇。 将样品放在一80°C 30 m i n ，沉淀核酸。 11•样品4°C ， 12 000 g 离 心 30 m i n 。弃去上清，用 2 m L 7 0 % E t O H 清洗核酸沉 淀物。 12. 干燥沉淀物，用 200 ^L T E 缓冲液重悬。 1 3 . 加 I (nL RNase One™去除样品中的R N A 。 14. 4°C 或 _20°C 保存 D N A 。 3 . 2 抑制消减杂交 以下描述的操作步骤是基于C L O N T E C H 的 P C R -Select™ 细菌基因组消减试剂盒 [Clontech Laboratorie, Inc. ， a Takara Bio C o . (2006) Clontech Laboratories, Inc.] 的厂家说明书。由于使用的是元基因组D N A 而非纯培养的基因组 D N A ，其中特殊步 骤已经修订。进一■ 步 的 信 息 可 查 看 iw MoZecwZar 丛 书 “〇 6776£^>?^- sion Prof ilin g ’’卷 的 “Suppression Subtractive H ybridization” 章 节 （ 5Q)。 3. 2.1 元 基 因 组 D N A 限制性酶切消化 用测试子、驱动子元基因组D N A 和对照 E . 基 因 组 D N A 进行下列实验。驱动 子 D N A 用来消减与测试子D N A 共同的片段，从而富集测试子 D N A 特有的片段。该 技术成功的关键是测定所使用的限制性内切酶的效价。具体地说，如果消化没有进行， 将会影响后续步骤的进行。在本实验中我们用A h I 为限制性内切酶。以 E . c d i 作为 对照 ，必 须 用 I 限制性内切酶。如果不用，就不能进行E . D N A 作为对照的相 关实验。 1. 标 记 3 个 0. 5m L 微型离心管如下： T (这个管将含有元基因组测试子D N A ) ， D (这个管将含有元基因组驱动子D N A ) 和 C (这个管将含有K 对 照 D N A )。 这些标记将贯穿整个操作过程。 2 . 加人以下试剂到相应标记的〇.5m L 微 型 离 心 管 中 （ 见 注 释 1): T 管 （ 元基因组测试子D N A ): 元基因组测试子D N A ( X 中 含 2 网 ） X 1A,
    IOX^UmI 限制性缓冲液 5. 0 ^ l L A i u i a o U ^ U 1.5 ^tL 灭菌去离子水 X 1XL 总反应体积： 50 D 管 （ 元基因组驱动子DNA): 元基因组驱动子DNA (X 中含2 Mg) XpL IOXAZmI 限制性缓冲液 5. 0 A l u i a Q UZmU 1.5 iiL 灭菌去离子水 X 1ML 总反应体积： 50 C 管 CE. coZz•对照 DNA): coZi 对照 DNA(X， 中含 2 Mg) X 1IL 10Xi?sa I 限制性缓冲液 5. 0 fiL Rsa I (10 U, juL) 1.5 fiL 灭菌去离子水 X 1IL 总反应体积： 50 3. 轻轻拍打管底混匀，短暂离心。漩涡混合可能会出现非特异性限制性内切酶 D NA 的表面消化现象。 4. 37°C 孵育 5〜16 h 。 5. 用 5 消化过的混合液分析消化效率。 0 •2 鸿没有剪切过的元基因组D N A 和 5 fxLA h I 消化过的元基因组D N A 在 1% 琼脂糖凝胶0 •5X TBE缓冲液中电泳。 一起比较电泳结果。未消化的高分子质量基因组D N A 条带应该出现在胶的上方 高 于 I kb D N A 分子质量标准的 位 置 （ 这也将依赖于从环境样品中提取D N A 的 方法。有些方法更倾向于D N A 剪切，如应用珠子） 。相反， AZw I 消化过的 D N A 大小显著降低（ 如果不是这种情况，请看注释2)。 6•加2. 5 y L 0. 2 mol/'L E D T A , p H 8. 0 , 终止反应，把液体转移到I.5m L 管中。 7•加450 灭菌去离子水，使体积为500 / xL。接着加入500 ( u L 苯 酚 ：氯 仿 ：异 戊 醇 （25 : 24 : 1)(这会最大限度地减少第10步去除上清液时的原料损失） 。 8. 漩涡混匀。 9. 10 000尽离心分离1〇 min。 1〇 •转移上层水相到干净的I.5m L 管中。 11•加500 A 氯 仿 ：异 戊 醇 （24 : 1)，彻底漩涡混匀。 12. 10 〇〇〇 g 离心分离 1〇 m i n。 13. 转移上层水相到干净的1.5m L 管中。 14. 加 I fxL糖 原 （20 m g /m L )， 0.1倍体积的5 mol,' L 乙酸钠， p H 5. 2, 2 倍体积 的 1 0 0 % 冰乙醇[如果上层水相体积为500 p L ，则 加 I fiL糖 原 （20 m g /m L )， 50 piL 5 mol/L 乙酸钠 （p H 5. 2 ) 和 1000 100%冰乙醇]。 15•彻底涡旋混匀。 16.室 温 10 O O O g 离 心 15 min。应有白色小D N A 沉淀于管的底部（ 如果没有，请
    看 注 释 3)。 17•小心去除上清液。 18. 加人 200 fxL 8 0 % 乙醇。 19. 10 〇〇〇 g 离心 5 m i n 。 20. 小心去除上清液。 21•风干沉淀物5〜10 m i n 。 22. 6. 5 H zO 重新溶解 沉 淀 物 ，储 存 于 一20°C 。驱 动 子 D N A 终浓度应为约 300 n g 'p L 。 3 - 2 . 2 接 头 连 接 对每个元基因组测试子D N A 和对照测试子 D N A 必 须 进 行 3 个接头连接反应。每 份 D N A 分到两个管中：一份与 接 头 1 (测 试 子 T l 和 C l ，根 据 3.2.1 “T ” “C ”标记） 连接，第二份与接头2R (测 试 子 T 2 和 C 2 ) 连接。在第三个管中，把各成分混合，这 样 D N A 就 与 两 个 接 头 （ 未消减测试子对照T - c 和 C -c) 连接。每个未消减的测试子对 照 D N A 作为消减实验的阴性对照。消减实验中的一个阳性对照测试子D N A 是 由 I 消化的对照E . co“基因组 D N A 与试剂盒提供的对照D N A (0X 174/H a e flI消化）混合 而成。 1•标记两管分别为“稀 释 T ”、“稀 释 C ”。用 1.8 F L 灭菌去离子水稀释U fjtL 相 应的限制性内 切 酶 消 化 的 实 验 D N A 。消 化 过 的 元 基 因 组 测 试 子 D N A , 来自 3. 2 . 1 的 管 T , 将 放 到 “稀 释 T ”，而消化过的对照£. coh D N A , 来 自 3.2. 1 的 管 C ，将 放 到 “稀 释 C ”。 2 . 准备阳性对照测试子D N A : a. 含有对照D N A (试剂盒提供的， 0X 174,'H ae]] I消化过的）的管短暂离心。 b. 用 42 / i L 灭菌去离子水稀释3 ( u L 对 照 D N A (稀 释 到 0. 2 ng/^L )。 c. 把 U j u L f o a r 消化过的对照E . 基因组D N A (300 ng/M L ) 与 1.8fxL稀 释 的 0X 174/H M H I D N A 混合。这就是对照测试子D N A (见 注 释 4)。 3 . 在 0.5m L 微型离心管中混合下列试剂来制备连接主体混合物。为了保证有足够 的主体混合物，制备足够所有连接反应外加一个额外反应的体积。 每个反应 灭 菌 去 离 子 水 . 4 fxL 5X 连 接 缓 冲 液 2 T4 DNA 连 接 酶 （ 400 U/fxL) I iiL 4 . 配 制 元 基 因 组 测 试 子 D N A (标 记 为 T l 和 T 2 的 两 个 管 ） 和 对 照 测 试 子 D N A (标 记 为 C l 和 C 2 的 两 个 管 ） 时 ，按 下 面 的 顺 序 加 入 试 剂 混 合 。用 移 液 管 彻 底 混 匀。 管 号 ： ' T l T 2 Cl C 2 成 分 （ fxL) (/xL) (juL) (/xL) 稀 释 的 测 试 子 D N A * 1 1 1 1 接 头 1(10 m m o l , ’L ) 2 — 2 —
    接头 2R (10 m m o l /L ) — 2 2 主体混合物 7 7 7 7 终体积 10 10 10 10 5. 在标记T -c 的新微型离心管中，混 合 I.5 斗 测 试 子 T l 和 I.5 测 试 子 T 2。 这将被作为未消减测试子对照T -c。同样处理对照测试子D N A (测 试 子 C l 和 C 2 : 标记新管为C-c)。在连接后，每个未消减测试子对照中大概P 3 的 D N A 分子末端有两个不同的接头。 6. 管短暂离心， 16°C 孵育过夜。 7. 加 I 0. 2 mol/L E D T A 终止连接反应。 8. 72°C 加热样品5 m i n 使连接酶失活。 9. 快速短暂离心。实验组和对照组接头连接的测试子D N A (T 1、 T 2、 C l 和 C 2) 现在制备完毕。 10. I 未消减的对照测试子（ T -c 和 C -c) 分别稀释到含I m L 水的管子中。这 些样本将被用于后期P C R 扩增。 11. —20°C 保存样本。 3 . 2 . 3 连 接 分 析 这里介绍的是针对Clontech试剂盒中的对照组大肠杆菌基因组D N A 接头连接的质 量控制实验。引物将扩增大肠杆菌23S r R N A 基因中的374b p 区域，以用来证实至少有 2 5 % 的对照组D N A 片段两端都有接头。扩增片段覆盖测试子C 1 和 C 2 D N A 与接头接 合 处 （ 见注释5)。 1•每个大肠杆菌对照连接D N A (例如测试子C l 和 C 2) I p L 分别稀释在200 H 2O 中。 2•用下列模板与引物的混合物设置4 个 P C R 反 应 （ 体积单位p L ): 1 2 3 4 测试子Cl (连接到接头1) 1 1 - - 测试子C 2 (连接到接头2R ) — — I 1 23S R N A 正 向 引 物 （10 m m 〇l/L ) I l l l 23S R N A 反 向 引 物 （10 m m o F L ) — 1 — 1 P C R 引物 I (10m m o l /L ) 1 — 1 — 总体积 3 3 3 3 3. 制备所有反应外加一份主体混合物，按下面的顺序混合试剂准备好每个反应： 反应管各成分的体积（ fxL) 4 个反应的体积CjliL) 无 菌 H 2O 18.75 93. 75 I O X P C R 反应缓冲液 2.5 12.5 d N T P 混 合 液 （1 0 m m o l /L ) 0 •5 2.5 总体积 21.75 108. 75
    4 . 涡旋混合后快速离心。 5 . 上面步骤2 的各个反应管加人21. 75 主体混合物。 6 . 涡旋混合后快速离心。 7 . 在 热 循 环 仪 （Applied Biosystems G e n e A m p ® System 9700) 72°C孵育反应混合 物 。温度一达到72° C 就停止热循环仪，每管加人〇.罚 fxL T a K a R a E x 了叫D N A 聚 合 酶 （1.25 U ) (见 注 释 6)。孵 育 管 2 m i n 来延伸接头。这可填补接头的缺失 链 （ 图 1)，为 P C R 引 物 1 建立结合位点。在这阶段，勿从仪器中移出样本。 8 . 立 即 启 动 热 循 环 （ 使用 Applied Biosystem s GeneAmp® System 9 7 0 0 ): •94〇 C 30 s 2 3 个循环： •94〇 C 10 s •65〇 C 30 s •68°C I min 最 终 72°C 延 伸 7 m i n , 然后 在 4°C 维持。 9 . 通 过 2 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 （0.5X T B E 缓冲液中）检测产物。如 果 在 2 3 个循环 后未能见到产物，则可以加4 个循环后再通过琼脂糖凝胶电泳进行分析（ 见注 释 7)。 3 . 2 . 4 第一次杂交 在第一次杂交中，加入过量的驱动子D N A 到测试子D N A 中，样本被热变性后再复性。 1•对每个元基因组（ H T ) 和 对 照 组 （ H C ) 消减反应，按 以 下 顺 序 在 0.2 m L 微 离心管中混合试剂： 成分 杂 交 样 本 H T l h U 杂交样本 H T 2 (p L ) A Z w I 消化的驱动子D N A 2. 0 2. 0 接 头 1 连接的测试子T l L O — 接 头 2R 连接的测试子T 2 — 1.0 4 X 杂交缓冲液 1.0 1.0 终体积 4.0 4.0 2 . 热循环仪中98°C 孵育样本 I.5 m i n 0 3. 63°C 孵 育 1.5 h ，然后立即进行下一步操作（ 见 注 释 8)。 3. 2. 5 第二次杂交 在第二次杂交中，来源于第一次杂交的两个样本被混合，刚变性的驱动子D N A 被 加人以进一步富集测试子特异的序列。这 样 ，对应于末端带有不同接头的测试子特异的 D N A 的新的杂交分子形成了。 在这一阶段不要将原始杂交样本进行变性，加人新鲜驱动子时也不要长时间从热循 环仪中移出杂交样本。对实验组和对照组的测试子D N A 重复下列步骤。 1 . 用等量的去离子水稀释4 X 杂交缓冲液成为2 X 杂交缓冲液。 2 . 在一个无菌的0.2m L 微离心管中混合下列试剂：
    A Z m I 消化的驱动子D N A * ImL 2X 杂交缓冲液 1/xL 3. 在热循环仪中98°C 孵 育 I.5 min。 4. 从热循环仪中取出刚变性的驱动子管子。按下列步骤同时将驱动子与杂交样本1 和 2 混 合 （ H T 1 和 H T 2 代表元基因组D N A ， H C l 和 H C 2 代表对照组大肠杆 菌的 D N A )。这将确保两个杂交样本只在驱动子存在的情况下混合。 a. 将微移液器设置在15 p L 。 b. 用吸头轻轻触碰杂交样本2 管 子 中 的样本表面（ H T 2 代表元基因组样本， H C 2 代表对照组大肠杆菌样本） 。 c. 将整个样本小心地吸入到移液器中。 d. 将移液器移出管子，吸入少量空气使得微量样本下面有少量空气。 e. 对含有刚变性驱动子的管子重复步骤b〜d 。现在移液器中应该含有两个被空 气隔开的样本了。 f. 将整个混合物转移到含有杂交样本I (H T l 代表元基因组样本， H C l 代表对 照组大肠杆菌样本）的管中。 g•用移液器混合。 5. 如果需要可以快速离心管子。 6. 63°C 孵育过夜。 7 . 加 入 200 稀释缓冲液并混合。 8. 63°C 加 热 7 m i n 消除非特异性杂交。 9•一20°C保存。 3- 2. 6 P C R 扩增 在下面的P C R 中，测试子特异的D N A 片段被选择性扩增。通过一个短暂的72°C 的 预 处 理 （ 这 为 P C R 引物1 创造了结合位点） ，接头的缺失链可首先被“填补” （filled in)。在这以后，在 P C R 扩增的第一轮循环中，只有在末端带有不同接头序列的d s D N A 才被扩增。而在第二轮循环中，利用巢式P C R 扩增测试子特异的序列从而降低背景。 至少准备5 个反应： 1•消减元基因组 D N A ( t h e subtracted megagenomic D N A ， H T 1/H T 2 的混合物） 。 2•未消减元基因组测试子的对照（the unsubtracted metagenomic tester control， T -c)。 3 . 消减对照组大肠杆菌 D N A ( t h e subtracted control D N A from E . coZi, H C 1/H C 2 的混合物） 。 4•未消减的消减对照组测试子对照（the unsubtracted tester control for the control subtraction, C -c)〇 5, P C R 对照消减的 D N A ( t h e P C R control subtracted D N A ，试剂盒提供） 。 试剂盒提供的P C R 对照消减的D N A 作为阳性对照含有H a e D I 消 化 的 +X 174D N A 片段的消减混合物，可直接与来源于大肠杆菌的消减对照D N A 进行比较。此外，为了
    确 保 T 叫 D N A 聚合酶的催化效率也应该使用一个标准的P C R 对照。 . 1. P C R 模板准备如下： a. 将 I ^ L 各个稀释的D N A (例如消减的样本和相应的稀释的未消减的测试子 对照）加人到标记好的管中：制备好的元基因组消减样本（ H T 1/H T 2)，稀 释的元基因组未消减样本（ T -c)，大肠杆菌消减样本（ H C 1/H C 2 ) 和稀释 的大肠杆菌未消减样本（ C -c)。 b. 将 I f x L 的 P C R 对照消减D N A (试剂盒提供）加入到一个标记好的管中。 2. 为所有的P C R 管准备主体混合物。按以下顺序混合试剂： 成分 每 个 反 应 的 量 （ m l ) 5 个 反 应 的 量 （ m L ) 无菌水 19.75 118.5 10X P C R 反应缓冲液 2.5 15.0 d N T P 混 合 液 （1 0 m m o l ,' L ) 0. 5 3.0 P C R 引物 I (l O m m o l ./L ) L O 6. O 总体积 23.75 142.5 3 . 涡旋振荡混匀，短暂离心。 4 . 将 23. 75 ( n L 主体混合物加人第 1 步的每个管中。 5•在热循环仪（ A B I G ene A m p ® S y s t e m 9700)中72°C 孵育反应混合物。温度一达 到 72°C 就停止热循环仪，每 管 加 入 0 •25 fxL T a K a R a Ex Tag D N A 聚合酶 (1. 25 U ) (见注释6)。孵 育 2 m i n 来延长接头。在这个阶段，不要把样品从热 循环仪中移出。 6. 立即启动热循环（ 应用生物系统GeneAmp® System 9700): 开始启动保持在94 °C 5 min 25个循环： •94°C 10 s •66°C 30 s •72°C I.5 min 最终在72°C 延 伸 7 m i n，保持在4°C 。 7 . 根据所用的T叫 DNA聚合酶，可能另外要多加3〜5 个循环。在我们的实验中， 用的是TaKaRa Ex Tag DNA聚合酶，我们通过额外的5 个循环得到最佳结果。 8•每管吸出7 y L 用 2 % 琼脂糖凝胶在0. 5 X T B E 缓冲液中进行分析。你可以先把 这 些 7 fxL样本放在一边，与二次P C R 产物一起电泳（ 下面的第1 6 步）分析。 9. 取 1 斗 每 个初 级 P C R 产物稀释到3 9 卩 LH2O 中。 1 0 . 取 IyL 来自上一步的每个稀释的初级PCR产物移到相应标记的管中。 1 1 . 按下面的顺序加入试剂混合，制备二级PCR的主体混合物。 试剂 每 个 反 应 的 量 W L ) 5 个 反 应 的 量 （ ^L ) 灭菌水 18. 75 112.5 IO X P C R 反应缓冲液 2.5 15.0 巢 式 引 物 1 (10 m m ol/L ) 1.0 6.0 巢式引物 2R (10 m m ol/L ) 1.0 6. O
    SdNTP 混 合 物 （ l O m m o l /L ) 0.5 3.0 总体积 23.75 142.5 12.充分涡旋混合并短暂离心。 13•每个反应管加人23.75 p L 主体混合物，在 热 循 环 仪 （Applied Biosystems G e - n e A m p® System 9700)94°C 孵育反应混合物5 min。温度一达到94°C 就停止热 循环仪，每管加人〇• 25 T aK aR a E x T 叫 D N A 聚 合 酶 （1. 25 U ) (见注释 6)。 14•立即启动热循环（Applied Biosystems G e n e A m p ® System 9700): 10〜12个循环： •94〇 C 10 s •68〇 C 30 s •72〇 C I.5 min 最终在72°C 延 伸 7 m i n，保持在4°C 。 1 5 . 根 据 所 用 的 D N A 聚合酶可能另外要多加3 〜5 个循环。在我们的实验中， 用的是TaKaRa E x Tag D N A 聚合酶，不需要额外的循环（ 一 共 1 2 个循环） 。 16. 每管吸出7 用 2. O % 琼脂糖凝胶在0. 5X T B E 缓冲液中进行分析。 17•反应产物储存于一20°C (见注 释 9)。 3 . 2 . 7 PCR 产 物 分 析 1. 琼脂糖凝胶电泳分析初级P C R 产物。对于 P C R 对照消减D N A ， 25个循环后显 现的主要条带应对应于0X 174/H a e IE片段。这结果应该与对照消减的结果类 似。 0X 174/H aeEI条带可能仅在二级P C R 后出现—这是正常现象。在这个阶 段 ，对照反应成功是元基因组D N A 消减起作用的唯一指征。元基因组D N A 试 验消减得到的初级P C R 产物应该呈现为0. 2〜2 k b 范围内的模糊条带。元基因 组 D N A 的成功消减需通过随后的Southern印迹来进一步确认。接下来的是有 关如何解释此时的结果的指导方针以及一些基本问题的解决方法。 a. 如果在25个循环之后不能看到任何产物，那就接着多进行3〜5 个循环，并 通过凝胶电泳分析产物（ 正 如 3. 2. 6 中注释，我们的试验要求总共3〇个循 环） 。 b•如果P C R 产物不能在消减[E . c W i 消 减 样 品（ H C 1, H C 2 ) ] 或 未 消 减 （ 未 消减测试子对照G e ) 样品 或 P C R 对照消减D N A 中检测到，那就确认一下 Tag D N A 酶是否起作用。如 果 T 叫 D N A 酶正常，那么试一下优化P C R 循 环参数。可逐步降低复性或延伸温度。降低这些温度明显增加本底值。开始， 试一下将复性温度从66°C 降 到 64°C 。延伸温度应在更小程度上降低（ 如从 72°C 降到 71°C )。 c•如果P C R 产物在未消减（ 未消减测试子对照C - c ) 样品中检测到，而不是在 消减样品中检测到，那就稀释初级P C R 产物，增加二级P C R 循环数。 2. 琼脂糖凝胶电泳分析二级P C R 产物。来 自 P C R 对照消减D N A 和 £• 对照 消减的二级P C R 产物条带应该类似（ 可能出现少量背景条带） 。由于元基因组
    的高度复杂性，与纯培养不同，实验消减样品的条带很模糊。反之，纯培养 D N A 消减实验样本除了模糊条带外，还应有几条清晰的条带出现。 a . 如果预期的0X 1 7 4 /H a e IE条带出现在P C R 对照消减D N A 样品中，而没有 出现在对照消减样品（ 如模糊条带或任意大小的条带出现）中，那么这可能 是消减中出现问题。连接效率非常低可能是—个原因。如果连接效率不存在 问题，那么要检查一下操作步骤是否正确。 b. 在 12个循环后没有看到产物，再多进行3 个循环，并再一次用凝胶电泳确认 产物。增加循环要慎重：循环次数太多会增加背景。 c. 如果在PCR对 照 消 减 D N A样品中没有看到0X 174/HaeEI条带，需优化 PCR参数。由于T叫 DNA酶 和 PCR仪型号不同，所以很多PCR参 数需要 实际摸索。 d. 在一个成功的消减中，与两个接头同时结合的未消减DNA (未消减测试子对 照 T-c) 条带类型应该与实验消减DN A样品的不同。对于元基因组DNA， 这有时候可表现为扩增产物模糊条带的位移而被检测到。 3 . 2 . 8 消 减 后 富 集 片 段 的 克 隆 文 库 在接下来的步骤中，来 自 元 基 因 组 消 减 （3.2.6 H T 1/H T 2 ) 的 4 二 级 P C R 产 物将克隆到p C R ®4-T 0 P 0 ® 载 体 （ Invigrogen) 并通过电穿孔法转移到£• . coK T O P l O 细 胞 （ Invigragen) 中。所描述的操作步骤基于 T O P O T A Cloning® 测 序 试 剂 盒 （ Invitrogen) 的厂家说明书。 1. 设置以下反应体系： 二级 PCR产物 4 pL 稀释盐溶液 I FL T0 P0 ® 载体 1 ， 终体积： 6 fxL 在 T 0 P 0 ® 克隆反应体系中加人稀释盐溶液，使 体 系 中 的 N a C l 和 M g C l 2的终浓 度分别为 50 m m o l / L 和 2. 5 m m o l /L 。 2 . 轻轻混合，在 室 温 （22〜23°C ) 孵 育 5 m i n 。 3. 把反应体系放到冰上。 2 T O P O ® 克隆反应体系加到〇 ne Shot® Electrocom - p eten t E . c o K 管中并轻轻混勻。不要用移液管吹打混匀，而是轻轻搅拌。把剩 下的克隆反应体系放到一20°C 保存。 4•小心转移液体到0.1cm电穿孔皿，避免形成气泡。 5 . 电穿孔样品。条件为： 2_ 5 k V ， 25 p F ， 200 〇，使用 B io R a d 的 G eneP ulser™ (见 注 释 10)。 6. 立刻加人250 y L 室温的S O C 培养基。 7. 立即把转化子平铺到含有1〇〇 pg/m L氨苄青霉素的L B 琼脂平板上， 37°C 温育 过夜。平铺两块不同浓度的转化子，确保至少一块平板有分隔很好的克隆。一 个有效的T 0 P0 ® 克隆反应体系应该产生几百个克隆。 8. 任意挑取9 6 个转化子，在 200 juL含有氨苄青霉素的L B 培养基 中 37T：温育
    2 h 0 9. 利用初级PCR的循环条件，但来自二级PCR的引物确认已经克隆插人，并用 于斑点印迹和S o u th e rn 印 迹 （ 见 3. 2. 6)。用 I pL 细胞培养作为PCR筛选的 模板。 10. 转化子培养物在含有L B 培养液与甘油（1 : 1 比例）的 96孔板中，一80°C 保存。 3 . 3 通过斑点印迹和Southern印迹确认测试子特异DNA片段 S S H 的效率可以通过斑点印迹和S o u th e rn 印迹来测定。在斑点印迹过程中，克隆 的消减片段点到膜上，与测试子元基因组D N A 探针杂交，再与驱动子元基因组D N A 探 针 杂 交 （ 图 2A )。 S o u th e rn 印迹的方法也类似，只是用克隆的消减片段作为探针检 测含有测试中和驱动子元基因组D N A 的限制消化片段的膜（ 图 2B)。如果 S S H 过程成 功 ，在两种印迹检测中消减片段与驱动子元基因组D N A 应没有或极少有杂交。这里所 描述的方法用的是放射标记的D N A 探针，但其他标记方法也适用。所有膜操作应该用 无菌朝■操作。 [有关S o u th e rn 印迹更详细的资料请参考Cwrrewi ProiocoZs MoZecwZar BioZo^y 丛 书 （51)]。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 _ _ 遽 b A B C D # EF , ■鏐 ，V 声 • 等 G H B LHlO T D C08 T D E08 T D L A04TD CIO T D a b c d e 图 2 来自测试子瘤胃元基因组样品的消减文库随机选择克隆的杂交分析。 (A) 9 6 个随机选择的克隆的PCR扩增子用斑点印迹歧管转移到尼龙膜上， 与来自测试子元基因组（ a) 或 驱 动 子 元 基 因 组 （ b) 的32P 标记的基因组 DNA杂交。 （ B) 5 个 克 隆 的 Southern印迹。分 别 来 自 测 试 子 （ T ) 和驱动 子 （ D) 的消减克隆和AZmI 消化的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳后，转 到尼龙膜上，分别与对应的32P 标记的消减克隆杂交。 （ L) 为 I k b DNA ladder (Invitrogen)。克隆 H10(a)、 C08(b)、 E08(c) 和 A04(d) 是随机选 择的。克 隆 C10(e) 被选为阳性对照探针用来确认斑点印迹的结果[转载 自 Galbraithetal. (2004) (7)Blackwell 出版社许可]
    3. 3 . 1 斑 点 印 迹 膜 的 制 备 1. 按 照 QIAquick P C R 纯 化 试 剂 盒 （ Q I A G E N ) 说明书，纯化随机选定的转化子 P C R 产物。这样所得的纯化D N A 终体积为每管约50 juL。 2 . 将 1 0 ^ ? 0 ^ 产物稀释于4 0 ， 1111〇1,/1他 € « ， 5 |^ 2 0 〇 111111〇1 /1 ^ 0 丁八， ？ ?1 8. 2, 45 无菌水。热循环仪中卯.9 ° C , 10 m i n 加热变性P C R 产物。 3 . 按厂家说明制备斑点印迹歧管。裁剪大小合适的带电尼龙膜（ H ybond N + ) ，放 置于一托盘蒸馏水水面上，通过毛细现象使膜湿润。淹没浸泡膜10 m in。 4 . 裁剪大小合适的滤纸，无菌蒸馏水浸泡后把它装到歧管上。 5•膜放在滤纸上方，组装歧管，确保没有气泡留在歧管装置里。 6•每孔加入500 无 菌 ddH20 预洗膜。如果需要，可以加入少量的溴酚蓝染料 到预洗水中（ 见 注 释 11)。 7•打开真空泵，让水慢慢透过膜。然后，关掉真空泵，慢慢打破真空密封。 8 . 把变性D N A 样本放到膜上（ 一个样品一个孔） 。 9. 再一次打开真空栗，让 D N A 进人膜中，样品中的液体透过膜。 10. 每孔用500斗0. 4mol/L N a O H 冲洗，并拆除歧管。 11•用2X S S C 短暂冲洗膜并风干10 m in。 12•将膜包在紫外线透明塑料薄膜中，按厂家说明，使用紫外交联仪（ S tratalin ke r， S tratag en e) 将 D N A 与膜交联。 13•干燥的膜在室温下可储存2〜3 个月，在 4 ° C 时间更长。 3. 3. 2 S o u t h e r n 印 迹 膜 的 制 备 1 . 按 照 QIAquick P C R 纯 化 试 剂 盒 （ Q I A G E N ) 说明书，纯化随机选择的转化子 的 P C R 产物。这样所得的纯化D N A 终体积为每管约50 juL。 2 . 把约50 n g 纯化的消减片段， 1吨消化的测试子元基因组D N A (用与用于SSH 相同的限制性内切酶完全消化）和 I / x g 消化的驱动子元基因组D N A (也完全 消化）分别加到0.8%琼脂糖凝胶的泳道内， 0.5X T B E 缓冲液电泳。电泳凝胶 80 V 3 h ，用 0. I ‘m L E tB r染色，用紫外透射分析仪观察。 3•通过一系列室温下清洗来准备凝胶进行D N A 转移。约1〇倍凝胶体积的清洗液 放到玻璃盘里慢慢摇动胶进行清洗。每次清洗之间，凝胶应该用蒸馏水冲洗。 用 0. 25 mol,'L H C l 洗 3〇 min —次，变性缓冲液洗20 m i n 两次，中和缓冲液洗 20 min两次。 4 . 约 1 L 2 0 X S S C 注人玻璃盘。在盘上放能够把胶放置其上的固体支撑物。在支 撑物的两边留出空间，让滤纸芯悬挂浸到20X SSC中。 5•裁剪Whattman 3 M M 滤纸芯，其宽度与凝胶的长度一样，其长度要足以覆盖 支撑物并两边都悬挂浸到20 X SSC 中。用 20 X SSC湿润该芯并把它放到支撑 物上。 6•把凝胶放在滤纸上并挤掉所有气泡
    7 . 裁剪和凝胶大小一致的带电尼龙膜（ H y b o n d N + )，平铺在一托盘蒸馏水水面 上，毛细现象使膜湿润。淹没浸泡膜10 min。 8 . 湿膜放到凝胶表面上。用玻璃管在表面缓慢滚动移除所有气泡。用 20X S S C 淹 没膜。 9•裁剪5 张与膜一样大小的W h a t t m an 3 M M 滤纸，叠加在膜上。折叠或裁剪纸 巾与膜一般大小，再放在滤纸上面。 10•铺一固体支撑物在纸巾上，加一重物在支撑物上以固定转移体系。 11. 室温下转移过夜。 12. 拆开转移体系，用铅笔在膜上标记凝胶孔的位置和胶的方向。 13. 用 2 X S S C 短暂冲洗膜，并风干10 min。 14. 将膜包在紫外线透明塑料薄膜中，按厂家说明，使用紫外交联仪（ Stratalinker， Stratagene) 将 D N A 与膜交联。 15•干燥的膜在室温下可储存2〜3 个月，在 4 ° C 时间更长。 3. 3. 3 用 于 斑 点 印 迹 和 Southern印 迹 杂 交 的 DNA 探 针 放 射 标 记 如果标记的探针保存在一20 ° C 并且在1 周内使用，可同时标记几个探针。斑点印 迹应首先用限制性内切酶消化的元基因组驱动子D N A ，然后用限制性内切酶消化的元 基因组测试子D N A 检测。按这个顺序杂交可减少洗脱后膜上残余的信号。用于元基因 组探针消化的限制性内切酶应该与消减过程使用的相同。对 Southern印迹而言，一个 探针应只含有一个纯化的消减片段。 1•用蒸馏水稀释纯化的D N A 探 针 到 10 ng/ML 。在沸水浴中加热5 m i n 变 性 100 n g 纯化的D N A 探针，然后立即放冰上冷却。 2 . 冰浴加人以下成分到变性探针中： 2 d A P T 溶液 2 d G P T 溶液 2 /xL d T P T 溶液 15 随机引物缓冲液 5 ptL(〜50 M Ci)[a-32P ]d C T P ， 3000 Ci/m m o l ， 10 MCi/ML 蒸溜水加至总量为49 pL 短暂混匀。 3 . 加人 I 1UL K le n o w 片段并彻底混匀。短暂离心后收集液体到管底。 4. 25 ° C 孵育 3 h 。 5 . 加人5 终止液，然后进行探针纯化或保存于一20°C最 长 1 周。 3. 3. 4 用 于 斑 点 印 迹 和 Southern印 迹 放 射 性 DNA 探 针 的 纯 化 杂交之前，需将 D N A 探针中未结合的d N T P s 、盐类和其他杂质去除。此处主要介 绍 Nensorb TM 20 核酸纯化分离柱（N E N Life Science Products, Boston, M A ) 的纯化 法 ；其他纯化方法也可使用。在接下来的实验操作过程中，无论是试剂或是样品，对分 •246 •
    离柱的压力要有限度，即溶液的流速不应该超过1 滴/2s。另外 ，到最后一步洗脱步骤 前应避免分离柱树脂干燥。 1. 将 一 只 Nensorb 2 0 分离柱夹到支架上，移除分离柱的保护盖，在分离柱下放置 一个废液收集烧杯。 2 . 加 2 m l 100 % 甲醇至分离柱。 3•将一个转接器牢固地接在分离柱的顶端，形成空气密闭。 4 . 在转接器的另一端接上一只5 m L的一次性注射器，缓慢推入，使甲醇通过分离 柱 ，直至液柱的弯月面到达分离柱树脂层的上端。 5 . 取下注射器和转接器，取 2 m L 试 剂 A 至分离柱。 6 . 重新接上转接器和注射器，注射器缓慢推入，使 试 剂 A 通过分离柱，直至液柱 的弯月面到达分离柱树脂层的上端。 7•取下注射器和转接器。 8•加200 试 剂 A 至标记探针，混 匀 ，将此混合物加到分离柱上。重新接上转接 器和注射器，注射器缓慢推人，将样品推至分离柱树脂层中。 9 . 取下注射器和转接器。 10. 洗柱 ：取 3 m L 试 剂 A 到分离柱，重新接上转接器和注射器，注射器缓慢推 入 ，使溶液的弯月面到达分离柱树脂层的上端。 11. 取下注射器和转接器，取 3 m L 分子生物学级水清洗分离柱。重新接上转接器 和注射器，注射器缓慢推入，使溶液弯月面到达分离柱树脂层的上端。 1 2 . 移开废液杯，取一只 无 菌 的1.5 mL Eppendorf管置于分离柱的底端，用以收 集纯化的探针。 13•取下注射器和转接器。 14•吸取500 fxL 5 0 % 甲醇水溶液至分离柱。重新接上转接器和注射器，将纯化的 探针洗脱到Eppendorf管 中 （ 持续洗脱，到没有液体流出分离柱为止） 。 15.纯 化 后 的 探 针 可 以 立 即 用 于 斑 点 印 迹 或 S o uthern印迹，或 者 保 存 于 一 20°C (可保存一周） 。所有探针的特异活性测定值至少为IO7 c p m /m g 。 3. 3. 5 斑 点 印 迹 和 Southren印 迹 膜 与 放 射 性 标 记 的 DNA 探针的杂交 在探针和杂交溶液的量做适当调整的情况下，多张膜与一种探针的杂交可以在一个 杂交瓶中同时进行，多张膜之间可用网丝隔开（ 见 注 释 12)。 1. 将膜小心地放人杂交瓶中，加 入 7 m L 预 热 的 （68°C )PerfectHybPlus杂交缓冲 液 （ Sigma-Aldrich) , 然后将杂交瓶放入旋转杂交炉， 68°C 作 用 15 m i n 。此步为 预杂交过程。 2 . 弃去预杂交液。 3•取100 n g 放 射 性 标 记 的 探 针 至 7 m L 预 热 的 （68°C )PerfectHyb P l u s 缓 冲 液 ， 轻轻混匀。 4 . 将含有探针的PerfectHyb Plus加入到含有膜的杂交瓶中。 5 . 将杂交瓶放入旋转杂交炉中， 68°C 作 用 16 h
    6. 倒去杂交液，加 人 50 m L 的 低 严 谨 度 洗 涤 液 。室 温 下 轻 轻 摇 晃 杂 交 瓶 洗 膜 10 min。吸弃洗涤液，再加人新鲜的低严谨度洗涤液重复洗涤一次。 7. 吸弃低严谨度洗涤液，加 50 m L 的中严谨度洗涤液至杂交瓶中，然后将杂交瓶 放入旋转杂交炉， 42°C作 用 15 min。吸弃中严谨度洗涤液，重复此步。 8 . 用 100 m L 2 X S S C 漂洗膜。 9 . 小心地将膜从杂交瓶中取出，包在透明塑料膜中，然 后 将 膜 磷 屏 曝 光 20 m i n 。 根据需要可以延长曝光时间。 10. 用成像系统获取磷成像板上的斑点图像。也可以用X 光片成像，但是曝光时间 必须延长至1〜3 h ，且必须使用 X 光机洗片。斑点印 迹 和 Southern印迹的实 例可见图2。 3 . 3 . 6 斑 点 印 迹 和 S o u t h e r n 印迹膜的洗脱 1 . 将湿膜置于玻璃盘中，然后在膜上倒入300〜 400 m L 煮 沸 的 0.1% SDS。轻摇 膜 ，直 至 〇. 1% SDS冷却至室温。 2 . 将膜取出，包在塑料薄膜中。此时膜可以用于重复杂交，或者可以在润湿的条 件 下 4°C 保存几天。 3. 4 总 RNA提取和16S rRNA斑点杂交 在 SSH 实验后，鉴定特异微生物在环境样品中的存在，并 决 定 它 们 的 16SrRNA 占测试子和驱动子样品中总16S rR N A 的比例是非常有用的。为了此目的，需要设计针 对目标种群的DNA寡核苷酸探针。在这里所例举的研究中，我们想知道测试子和驱动 子瘤胃样本中细菌和古生菌的比例，因此需要使用区域特定的16S rRNA 探针。参照培 养 物 的 rRNA需作为对照以保证每种探针杂交的正确进行以及辅助定量。应选择适合 于要研究的元基因组的参照培养物。每 种 探 针需要一种参照培养物，且使用定量的 RN A 点样。参 照 rR N A 的杂交信号强度的测定可用来估计环境样本中rR N A 的量。下 面列出的总RNA 提取的步骤主要是参考Stahl等 （1 牝 8 ) 和 L in等 （1997) (52, 5幻 的方法，稍 作 修 改 [更 多 的 N orthren印迹文献信息请参阅Cwrrenf fVofoco。 iw MoZecMkr BioZogjy 丛书(51)]。 3. 4. 1 总 R N A 提取 1•于2. 2 m L 的 Eppendorf管中混合目标环境样本0. 8g, 400 fxL0.1mol/L 磷酸钠 缓 冲 液 （p H 6. 0)， 400 乙酸盐缓冲液（p H 5 .1)， 100 20% S D S (W /V )， 500 // L 苯酸'(pH 5. 1 ) 和 〇. I g 无菌 错 珠 （ 直径 〇. I mm)。 2•对于参照微生物，离 心 40 m L 培 养 物 （ 以大肠 杆 菌 BW13711或 M dceiiw raw s C2A 为例）后得到沉 淀 。 同 样 取 〇. 8 g 与 4〇〇 p i 0 •I m ol/L 磷酸钠缓冲液 (pH 6.0)， 400 , 乙 酸 盐 缓 冲 液 （ pH 5 .1 )， 100 //L 2 0 % SDS(W /V)， 500 fxL苯 酚 （ pH 5. 1) 和 〇• I g 无 菌 锆 珠 （ 直径 〇• I m m )在 2. 2 m L Eppendorf 管中混合。 3 . 所有样本60°C 孵 育 2 m i n 。
    4 . 用小型珠磨式研磨器往复式摇床（Biospec Products, Bartlesville， O K ) 匀浆所 有样品。 5 . 重复步骤3 和步骤4 两次。 6. 4°C ， 10 O O O g 离心样本5 m i n , 将上清液移至干净的管中。 7. 每个样本分别 加 入 I m L 苯 酚 （ pH 5.1)， 小型珠磨式研磨器振荡2 min。 4°C 10 000发离心样本5 m i n，将水相移至干净的管中。 8•每个样本分别加入I m L 苯酔-氯仿-异戊基 乙 醇 （125 : 24 : 1)， 小型珠磨式研 磨器振荡2 m i n 。 4°C 10 O O O g 离心样本5 m i n ，将水相移至干净的管中。重复此 步一次。 9 . 每个样本分别加人I m L 氯 仿 -异 戊 基 乙 醇 （24 : 1 ) , 小型珠磨式研磨器振荡 2 m i n 。 4°C 10 000 g■离心样本’5 m i n ，将上清移至干净的管中。 10. 加 人 5 0 ^ 乙 酸 钠 （3 111〇 1/乙 ）和1111乙预冷的甲醇至上清，一80°(：冷冻30 1^11 沉淀总核酸。 11. 10 000 g 离 心 15 m i n , 使核酸沉淀。 12. 用 I O O p L 8 0 % 甲醇洗漆沉淀，干燥，用 100/ A 无 R N a s e 水重悬。 1 3 . 样本用 I U / M g 的 R Q l 无 R N a s e D N a s e (P r o m e g a ) 处理， 37 ° C作用 30 m i n , 然后按照步骤7〜9 进行第二次抽提。 14. 按照步骤10〜1 2 进行核酸的再次沉淀和洗涤，不 同 的 是 最 后 用 40 p L 无 R N a s e 水重悬。 15. 260 n m 测定样本R N A 的 O D 值并估算浓度，用 1 % 琼脂糖凝胶在0.5 X T B E 缓冲液电泳确定浓度。最后将每个样本的R N A 浓度调至100 n g / > L 。 3. 4. 2 R N A 斑 点 印 迹 的 D N A 探针放射 性 标 记 D N A 寡核苷酸探针的末端标记可用多核苷酸激酶（ Iiwitrogen) 和 [7_32P ]A T P 进 行。标记实验过程中多核苷酸激酶的使用量根据探针与[Y-32P ] A T P 分子比I : 1 进行 计算。 1 . 在 I.5 m L E p p e n d o r f 管中，将以下试剂混合： 3. 0 |LtL 10 X 激酶缓冲液 1.5 ^xL 1% IGEPAL 计算量 寡核苷酸探针 计算量 [y-32P]ATP 1.0 IiL 多聚核苷酸激酶 再加人无 R N a s e 水将总体积补足至30 fxL。 2 . 探 针 37 ° C 孵 育 30 m i n 。 3. 65 °C加热探针2 m i n , 使多聚核昔酸激酶失活。 4•将探针放置在冰上，按 3. 3. 4 的方法用N e n s o r b柱纯化探针。 5 . 纯化后的探针可立即用于斑点印迹。或可以置于一2〇 °C 保存一周。所有探针的 特异活性测定值至少为IO7 c p m /m g
    3. 4. 3 R N A 斑点印迹膜的制备和膜与放射性标记D N A 探针的杂交 杂交的温度和最终膜的洗涤温度可由所使用探针的序列和长度确定。探 针 T m 、适 宜杂父温度，以 及 膜 洗 漆 温 度 的 计 算 可 参 见 ProiocoZs in MoZecwZar BioZog^ y 丛 书 （51)。多张膜与同一种探针的杂交可参见注释12。 I. 1 倍体积的 R N A 样本中加人3 倍体积的2 % 戊二醒，室 温 孵 育 10 m i n , 以使参 照和环境样本R N A 变性。将样本放置于冰上，用 无 R N a s e 水把样本稀释至合 适浓度。 2•按照3. 3. 2 的方 法 准 备 尼 龙 膜 和 斑 点 印 迹 歧 管 。每 孔 加 入 500 JLtL 无菌的无 R N a s e 水 预 洗 膜 一 次 （ 见 注 释 11)，真空中将水缓慢地抽过膜。 3 . 将变性的R N A 样本直接点到尼龙膜上，取出膜，然后按照3. 3. 2 的方法进行干 燥和交联操作。每 个 样 本 的 R N A 应 做 3 个 重 复 ，每 个 斑 点 的 R N A 量为 100 n g 、 50 n g 、 20 n g 、 5 n g 、 2 n g 、 0.5 ng 和 0. 2 n g ，每 次 的 点 样 体 积 为 100 p L 。 4 . 小心将膜放到杂交瓶中，加 人 7 m L 预 热 （40°C ) 的 PerfectHyb Pl u s杂交缓冲 液 （ Sigma-Aldrich)，然后将瓶放在旋转杂交炉中， 40°C 作 用 2 h 。这是预杂交 步骤。 5 . 在预杂交的最后10 m i n , 将探针放人水浴或恒温仪， 100°C 加 热 10 m i n 使探针 变性。 6 . 弃去预杂交液。 7 . 将 100 n g 变性且放射性标记的探针加入到7 m L 预 热 （40°C ) 的 PerfectHyb Plus杂交缓冲液，轻轻混匀。 8 . 将含有探针的PerfectHyb Plus缓冲液加入到有膜的杂交瓶内。 9. 将杂交瓶放人旋转杂交炉中， 40°C 作 用 16 h , 或者在通过探针序列和长度计算 出的合适温度下作用16 h 。 10. 倒去杂交液，加 人 50 m L 的 预 热 （40°C ) R N A 斑点印迹洗脱液。将杂交瓶放 人旋转杂交炉中， 40°C 作 用 l h 。倒去洗脱液并重复此步骤。 II. 倒去洗脱液，加 入 50 m L 新 鲜 的 预 热 （40°C ) 洗脱液。将杂交瓶放人旋转杂交 炉中在由特异探针计算得出的温度下作用3〇 m i n 。倒去洗脱液，将膜紧紧地包 在透明塑料膜中，按 照 3. 3. 5 的方法曝光。 12. 按 照 3. 3. 5 的方法获取杂交图像（ 图 3)。 13. 利 用 ImageQuant(Fujifilm) 或者其他软件测定斑点的光密度。 3. S DNA测序和生物信息学分析 在 经 Southern印迹对一种元基因组相对于另一种元基因组的克隆消减产物独特性 的确认后，消减杂交文库需要测序。详 细 的 D N A 测序和后继的生物信息学分析方法超 出本章的内容范围，读者可参见JVfe/ioc^ ire MoZecMZar 丛书的相应内容。 • 250
    图 3 草 食 牛 218和 256瘤 胃 样 本 的 16S r R N A 斑点印迹分析。将 218和 256瘤胃样本以及 i?_ 和 M e 成aMOiarciwaaceiz' wjrans菌 的 总 R N A 点样于尼龙膜上， 3 个平彳了样本，浓度分 别为 100ng、 5 0 ng、 2 0 ng、 5 ng、 2 ng、 0. 5 ng 和 0.2ng。 图 中 （ A ) 和 （ B) 显TK的是膜 与通用型32P 标 记 全 16S r R N A 特 异 探 针 （ S>~undefined-Univ-1392-a-A -1 5 ) 杂交的图像。细菌和古 生菌参照物， K 和 M . 被用来标准化每个瘤胃样 本 的 r R N A 浓度。 然后再 分 别 与 细 菌 特 异 （8"1>1^1;-0338-&-八-18)和古生菌特异（5~1>八1^-0915-&-八-20)的32? 标 记的探针杂交，分别见 图 中 （ C ) 和 （ D )。 4.注释 1 . 为了重悬D N A 和混合反应物沉淀，可以轻轻吹打沉淀，然后稍离心，使内容物 沉淀到底部。对于苯酸-氯仿抽提，旋涡混合反应物，总是最后将酶加人到反应 混合物中，轻轻吹打使酶彻底结合。有关试剂的量和浓度已经优化，不需要增 加酶的加人量或者反应中D N A 的浓度。 2 . 合适限制性酶的选择依赖于酶消化元基因组D N A 产生最佳长度产物片段的能 力 。为了判断样本是否被消化完全，可 在 消 化 I h 和 3 h 后取少量的 D N A 溶液 做琼脂糖凝胶电泳，观察D N A 片段的大小分布。如 果 D N A 大 小 分 布 相 同 （ 包 括与大肠杆菌阳性对照比较） ，此时就为消化完全。如 果 大 小 分 布 在 I 消化 后没有变小或大于2 k b ，则所选取的目标元基因组D N A 不 能 （ a) 被任何限制 性酶有效切割，原因可能是D N A 样本中含有某些抑制性杂质或（ b ) 被该内切 酶切割，原因 是 D N A 的 核 苷 酸 组 成 （ 元 基 因 组 D N A 的情况下可能性很小） 。
    如杂交温度优化的问题。在元基因组组成信息已知的情况下这个变量可进行修 正。例如，杂交温度依赖于特异基因组的G C 含量。平 均 G C 含 量 为 4 0 % 〜 51% 的基因组D N A 最佳温度为63°C 。如果基因组D N A 的 G C 含量非常低[如 产气荚膜梭菌（ CZosiri占 的 基 因 组 G C 含量只有26. 5 % ] , 杂 交温度则也需要降低。 9•此时P C R 混合物应富含测试子特异的D N A 。这些产物应被克隆并用于建立消 减 D N A 文库。扩增产物可以直接插人一个T /A 克隆载体。 10. 如果遇到电穿孔击穿的情况，可以先沉淀剩余的T O P O ® 克隆反应，用水悬浮， 然后再次尝试。样本被击穿的另一原因可能是细胞的体积，应该在50〜80 p L (0.1 c m 电穿孔杯）或者 100〜200 juL(0. 2 cm)。 11. 0.004%的溴酚蓝水溶液可作为斑点印迹的预洗液。染料会在膜的点样处有很 浅的着色。如果歧管调整合适，点样处的蓝色会继续保留。如果颜色在膜上流 失则说明歧管没有被调至合适的工作位置。另外，染色斑点可以明确地提示样 本点在膜的哪一面。 12. 当多张膜同时杂交时，需要相应的增加探针和杂交溶液的使用量。为了防止膜 在杂交瓶内重叠，可以切一张合适大小的网丝（ 如 Denville Scientific网丝） ， 放在各膜之间。
    此处的方法使用了 AZ m I ，但是还有另外的四碱基、产生平头末端的限制性酶: 几种六碱基、平头切除限制性酶的混合物也可以用于获得合适 的 D N A 片段。这种情况下，可以使用不同的限制性酶进行消化操作： 在每个反应管中加人以下试剂： 元 基 因 组 D N A (0• 2 g) X 1L1L 10 X 限制性酶缓冲液 1 .0 [xL 限 制 性 酶 （ I U ) 1 .0 pL 无菌去离子水 X ^ L 总体积 10 nL b . 涡旋混合，稍离心。 c. 37 cC 孵育 3 h 。 d. 用琼脂糖凝胶电泳分析消化的效率。在选择了合适的限制性酶后进行基因组 D N A 消化。如果没有限制性酶可以消化目标D N A ，原因可能是样本中含有 抑制反应的杂质，需要重复苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀操作。 3. 如果看不到白色沉淀，可以试将反应管放入一80°C 15 m i n，然后再离心。或者 加人少量的乙醇（ 每次增加1〇〇 JixL) 也可以帮助沉淀的形成。 4 . 测试子对照D N A 含有一个拷贝的H aeD I消化过的0X174 D N A ,'大肠杆菌基因组 (约5X I O 6个碱基对)。在测试子D N A 用驱动子D N A 消减后，最 终 P C R 产生 的主要条带应与0X174 D N A / H aeD I消化对照片段一致。 5•与对照大肠杆菌基因组D N A 成功的接头连接并不能保证与目标元基因组连接的 成功； D N A 样本中的杂质会抑制连接酶的作用。这个实验只能指示连接反应的 基本步骤已成功完成。另外，还应包括一个标准的P C R 对照以确认P C R 中使 用到的T ag D N A 聚合酶的工作正常。 6. 本方法中的循环参数和畔育是在Applied Biosystems G e n e A m p ® S y s t e m 9 7 0 0 上 进行的，使 用 T aK aR a E x T 叫 D N A 聚合酶。使用不同的热循环仪，丁叫D N A 聚合酶和模板则需要进行条件优化。在 P C R 过程中，必须使用热启动来减少非 特 异 D N A 合 成 （54)，其 他 方 法 也 可 以 获 得 期 望 的 效 果（ 如 ： TagStart抗体 (55)。我们使用了手动热启动的方法，在起始变性过程中加人 Tag D N A 聚 合酶。 7 . 用一种基因特异的引物（23S R N A 正向引物）和 P C R 引 物 1 扩增出的P C R 产 物的光密度值应与使用两种基因特异引物（23S R N A 正向和反向引物）扩增出 的 P C R 产物一致。如果这些P C R 产物条带的光密度值相差4 倍以上，那么连 接效率低于2 5 % 。这将明显降低消减效率，我们推荐此时重复连接反应。如果 23S R N A 正向引物和P C R 引 物 1 扩增出的P C R 产物在预期的374 b p 条带之外 还有一个574 b p 的条带，说明 D N A 没有被消化完全。如 果 574 b p 产物条带的 光密度值较高，建 议 再 进 行 I 消化。如果连接效果不佳，应在杂交之前重 复进行连接操作。 8. C L O N T E C H PC R -Select ™ 细菌基因组消减杂交试剂盒设计为用于微生物纯培 养物的基因组D N A 的操作。此时纯培养物的相关操作问题就变得比较简单，例

    来源：丁香实验

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