【求助】Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒的使用

我买了Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒，想研究某种材料的细胞毒性，看其是否会诱导细胞凋亡。之前做过MTT之类的检测，结果显示材料基本无毒性。

由于条件限制（流式细胞仪在我们学校另一个校区）不能及时进行检测，前两天进行了一次实验，是将细胞收集后拿到测试地点再进行的荧光染色处理，检测结果显示阴性对照组没有加材料处理的细胞也多处于凋亡状态，个人猜测可能跟细胞在路上耽误的时间有关（悬浮在Annexin V结合液中，冰盒中保存，距离染色有2小时之久）。

不知道这种情况是否还有其它原因？想请教下这种情况有没有什么好的处理方法？比如说能否将细胞先按照试剂盒说明染色完成后进行固定？如果先固定的话有什么方法不会破坏细胞膜的通透性吗？否则先固定再染色布都是死细胞了吗，PI都呈阳性了，这个该怎么处理呢？
另外，染色后是否需要离心去除细胞悬液中的背景荧光呢？有人建议离心，可是说明书上又没有提到离心操作？

期待懂行的朋友的回复！不胜感激！

按说在AnnexinV结合液中保存两个多小时是没有问题的，前几天有同学遇到细胞死亡过多的情况，结果是细胞在培养箱里被支原体污染了没有发现。
你用的冰盒是冰块还是碎冰？建议放在碎冰里
测凋亡不能固定的，固定细胞都死了，还测什么呀
染色后不用去背景荧光的吧，我们这里都是先加200ul buffer+5ul AnnexinV，过半个多小时后再加200ulbuffer+5ul PI，
然后染十几分钟就开测了。多做几次吧，重复一下

收细胞的时候转速要低于2000，还要看你收要细胞时候细胞状态，以及你处理过程中的操作……

Annexin V-FITC/PI 可以再原位进行检测么？？
另外楼主用的是什么材料？？细胞在铺在材料上边，还是包埋在材料内部？？

无图无真相啊！

请教楼主，我现在遇到的问题和以你一样，请问你的问题解决了，方便传授下经验么？谢谢哈

染色完了再固定。上机前加PI。过夜都可以测的。先固定的处理有可能会印象抗原的表位。