细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)

一、实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca 2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料

Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC） 20μg/ml

标记缓冲液（Binding Buffe） 20 ml

PBS（1×） 30 ml

量程分别为20μl , 200μl 和1000μl的移液器及吸头

微量离心管

可调速离心机

载玻片（用于荧光显微镜观察），盖玻片（用于荧光显微镜观察）

去离子水，冰块

流式细胞仪或荧光显微镜

三、实验方法

1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×10 6 /ml，备用。

2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。

3．重复步骤2两次。

4．将细胞重悬于200μl 标记缓冲液。

5．加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。

6． 加入300μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）或荧光显微镜观察检测。

四、 实验结果

用荧光显微镜观察，凋亡细胞细胞膜上可见黄绿色光环。PS转移到细胞膜外不是调亡所特有的，也可发生在细胞坏死中。以FITC标记的Annexin V, 可以同时结合使用PI(碘化丙啶)拒染法，用流式细胞仪分析可检测凋亡细胞的百分率。

五、注意事项

1．整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。

3．反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

4． Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

附：凋亡的其它检测方法

一、细胞凋亡的形态学检测

根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

　　1 光学显微镜和倒置显微镜

　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体.贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。

　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。