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Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法

&丁香园

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一、概述

在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧,细胞发生凋亡最早期,膜磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧,这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。


AnnexinV是一种磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI 则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。



图Annexin V 检测细胞凋亡原理


二、试剂盒组份

产品名称 规格
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I 100tests
产品组成成分:
Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E)
Annexin V-FITC (51-65874X)
Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)

三、实验步骤

贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加2%的BSA可防止消化过度。如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤,清除EDTA,以免残余的EDTA与Ca2+螯合,影响Annexin V的结合。

(1)用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer;

(2)细胞收集。悬浮细胞收集:离心5分钟;贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化收集后(注:胰酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合),于室温2000rpm离心5~10分钟,收集细胞;

(3)细胞洗涤:用预冷1×PBS(4℃)重悬细胞一次,2000rpm离心5~10分钟,洗涤细胞;

(4)加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞;

(5)Annexin V-FITC标记:加入5μL的Annexin V-FITC混匀后,避光,室温孵育15分钟;

(6)PI标记:上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

(7)上机前,补加200μL的1×Binding Buffer。

四、保存:

4℃保存;避免反复冻融。

五、注意事项

(1)本试剂只适用于实验,不适用于临床检测;

(2)PI(propidium iodide,碘化丙锭)有毒性,能通过皮肤吸收,对眼睛有刺激作用,使用时需戴手套;

(3)Annexin V-FITC和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。在处理和标记时,尽可能在暗处进行。在孵育阶段,用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后,在暗室内用显微镜观察;

(4)整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作,以免影响细胞状态。

(5)在细胞洗涤的最后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留,有可能会影响实验结果。

(6)为防止荧光衰变,宜在1小时内进行流式检测。

(7)PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-FITC染色,最短可在上机前5分钟再加入PI染色。、

其他Annexin V系列产品清单:

产品名称 规格
ANXN V FITC APOPTOSIS DTEC KIT I 100tests
ANXN V PE APOPTOSIS DTEC KIT I 100tests
ANNEXIN V RECOM FITC 100tests
ANNEXIN V RECOM PE 100tests
ANNEXIN V RECOM FITC 200tests
ANNEXIN V RECOM PE 200tests
ANNEXIN V RECOM APC 25tests
ANNEXIN V RECOM APC 100tests
ANNEXIN V RECOM APC 200tests
ANNEXIN V RECOM Cy5 100tests
ANNEXIN V RECOM Biotin 100tests
ANNEXIN V RECOM Biotin 200tests
ANNEXIN V RECOM Cy5.5 100tests
ANNEXIN V RECOM V500 50tests
ANXN V-FITC FLUORESCENCE MICROSCOPY KIT 25tests
Propidium Iodide Staining Solution 2ml
7-AAD Staining Solution 2ml



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