【求助】质粒转染细胞，western鉴定不行，求助
丁香园论坛
1145
我构建了一个质粒，包括目的基因片段和一小段启动子，测序结果完全正确，我们实验室的工作人员说理论上应该表达但是我转染细胞做WESTERN鉴定，就是不表达，请问这是为什么啊，谢谢各位大侠了
我用的是polyjet转染试剂，操作等基本没问题，谢谢大家了
以前我站构建质粒的时候也遇到过这种问题，最后换了一个载体以后就表达了。最后分析认为不同的基因可能有启动子喜好，一般情况下CMV启动子就可以了，如果不行可以试一下E2F1,AP-1等别的启动子的载体，希望建议对你有用。
pharmaceutic wrote:
以前我站构建质粒的时候也遇到过这种问题，最后换了一个载体以后就表达了。最后分析认为不同的基因可能有启动子喜好，一般情况下CMV启动子就可以了，如果不行可以试一下E2F1,AP-1等别的启动子的载体，希望建议对你有用。
谢谢您的建议，我现在的那个启动子不能换，目的基因也不能换。我想可不可以通过重新酶切，连接转化挑多个单克隆后提取多个同种质粒进行细胞转染鉴定，这样是否会有机会出现表达的成功质粒呢？谢谢
原来做的时候就是连续挑了3次，每次3-4个克隆，都没有挑到表达的质粒才换的载体。还有如果选的酶切出来的片段为平端的话，连接的时候可能会出现连接相反的情况，所以虽然测序正确，但不表达，这个时候多挑几个有可能挑到表达的质粒，如果不是这样的话，建议还是换一下载体试一下，当然也可能你比我lucky，多挑几个克隆能够挑出表达的质粒。
还有就是，不明白为什么启动子不能换呢？
还有就是，不明白为什么启动子不能换呢？
pharmaceutic wrote:
原来做的时候就是连续挑了3次，每次3-4个克隆，都没有挑到表达的质粒才换的载体。还有如果选的酶切出来的片段为平端的话，连接的时候可能会出现连接相反的情况，所以虽然测序正确，但不表达，这个时候多挑几个有可能挑到表达的质粒，如果不是这样的话，建议还是换一下载体试一下，当然也可能你比我lucky，多挑几个克隆能够挑出表达的质粒。
还有就是，不明白为什么启动子不能换呢？
谢谢您的回答，您所说如果连接相反的话，测序结果应该是错误的啊，怎么测序会是正确的呢？1-2-3-4和4-3-2-1肯定是不一样的啊。至于启动子，不是我不想换，是老板不让换，呵呵
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
