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人的外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

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人的外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

【实验目的】
掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。
【实验原理】
人外周血中的小淋巴细胞几乎都在G1期或G0期,一般情况下是不分裂的。当在离体培养条件 下加入植物凝血素(PHA),小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞,随后进入有丝分裂。 经过短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可获得大量的有丝分裂细胞。
【实验材料和用品】
  1、材料:人外周血淋巴细胞
  2、用具:注射器、离心管、吸管、试管架、量筒、 培养瓶、酒精灯、烧杯、载波片、切片合、天 平离心机、恒温培养箱、显微镜。 ? 使用的玻璃器皿在洗液中浸泡过夜,再用流水 冲洗过夜,捞起沥干,过三次蒸馏水后凉干, 干热间歇消毒或高压消毒。直接与培养细胞接 触的器皿,最后一过宜用双蒸水。橡胶制品不 能用洗液浸泡,应用1%钠溶液煮沸半小时以 上,流水冲洗后,高压消毒。
  3、 试剂 药品
  ① RPMI1640培养基,含有20种氨基酸,维生 素, 生物 素,碳水化合物,无机
  ② 凝血素(PHA)激活细胞分裂
  ③ 青霉素、链霉素为广谱抗生素
  ④ 小牛血清,促进细胞繁殖和维持PH值
  ⑤ 肝素,主要起抗凝血作用
  ⑥ 秋水仙索,使细胞分裂停止在分裂中期
  ⑦ 固定液,使血清蛋白、核蛋白凝固
  ⑧ 姬姆萨染液,使染色体染色。
【实验步骤】
  1、培养基的配制
  2、采血培养
  3、秋水仙素处理
  4、收采淋巴细胞及制片   
制片步骤
  吹打成悬浮转入 离心管 加少量生理盐水洗瓶顷入 离心管 → 离心 1000 转 / 分 8min → 去上清液,加入温育 蒸馏 水 6ml 吹打成悬液,置 37 ℃中低渗 25min → 加入固定液 1ml → 离心, 1000 转 / 分 8min → 去上清液,加固定液 6ml, 吹打,静置 15min → 离心, 1000 转 / 分 8min → 去上清夜,加固定液 6ml 吹打 , 静置 15min → 离心, 1000 转 / 分 8min → 去上清夜,加固定液 0.5ml 吹打至细胞成悬液 → 高空滴入冰玻片上 , 边滴边吹 → 用酒精灯烤干,贴标签,放于玻片盒里凉干待用
  用3瓶的一管做G带滴8片, 2瓶的一管做SCE滴5片. 标签分别为:
G
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